Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.
Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting “bacteriomimetic” materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial – host interactions.
Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell’s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions.
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9.
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.
Heri beskriver vi to protokoller, der kan anvendes til at koble thiolholdige proteiner amin- eller carboxylat-modificeret polystyren perler hhv. På grund af lethed af proceduren, thiol-amin kobling foretrækkes, men afhængig af den ønskede perle specifikation (diameter, fluorescensegenskaber), kan anvendelse af amin-funktionaliserede perler ikke mulig, og vi har derfor indeholdt en protokol, der vil omdanne carboxylat – i en amindel for at give forskeren størst mulig fleksibilitet i valg af stilladset. Selv om både thiol-amin og thiol-carboxyl kobling værk til ethvert cysteinholdige protein, retningsbestemt kobling (dvs. immobilisering af protein pr dets N-terminal, efterligner overfladen display) kræver et protein uden cysteinrester, er der produceres som et GST-fusion protein, eller som indeholder en enkelt terminal cysteinrest indført ved stedorienteret mutagenese. Hvis flere reaktive cysteiner er indeholdti proteinet, vil dette føre til tilfældige immobilisering, som kan hæmme proteinfunktion. Mange bakterielle adhæsiner indeholder ikke cysteiner naturligt. For andre, kan disse fjernes ved steddirigeret mutagenese, selv om dette ville kræve omfattende analyser for at sikre native struktur og funktion er tilbageholdt i mutanten. For GST-fusionsproteiner kan oprenses GST-tag koblet til perlerne anvendes som en egnet negativ kontrol. Brug af koblede perler som en kontrol bør undgås, da disse ofte har en højere tendens til at klumpe sammen eller klæbe til celler ikke-specifikt. En forenklet version af protokollen 1.2., Idet der kun EDC, kan anvendes til at koble proteiner til carboxyl-funktionaliserede polymerperler, men i dette tilfælde kobling sker via primære aminer i proteiner og derfor garanterer ikke retningsbestemt kobling.
TCEP som reduktionsmiddel må ikke erstattes med andre kommercielt tilgængelige og almindeligt anvendte reduktionsmidler, såsom dithiothreitol (DTT) eller 2-mercaptoethanol (BME), som thioler indeholdt i dem vil konkurrere med protein kobling i thiol-maleimid koblingstrin. PBS kan erstattes med andre buffere, men med følgende betragtninger: Buffere kan ikke indeholde primære aminer (så Tris-indeholdende buffere ikke er egnede). Anvendelse af buffere, der indeholder meget lave (<10 mm) saltkoncentrationer fører til perle sammenklumpning og bør også undgås. Proteinrenhed er også en vigtig faktor til at overveje under denne procedure, og for at opnå data af høj kvalitet, skal der anvendes rene proteiner. Vi rutinemæssigt at oprense proteiner i flere trin, herunder mindst en affinitet oprensning og gelfiltreringstrin, men i nogle tilfælde Ionbytterkromatografi udføres som et tredje trin. Som følge renheden af proteiner, der anvendes til kobling er sædvanligvis 90% eller derover, som bedømt ved SDS-PAGE.
Det anbefales at bestemme proteinkoncentrationer både i den indledende reaktionsblanding samt the supernatanten efter reaktionsfuldførelse. Dette vil bidrage til at bestemme den tilsyneladende koncentration af perle-koblet protein, og dermed kobling tæthed. Bestemmelse af begge værdier vil også tillade beregning af koblingseffektiviteten. Dette kan tages i betragtning ved fremstilling af oprindelige proteinopløsning i efterfølgende reaktioner, for at opnå den ønskede slutkoncentration og kobling tæthed. Bradford reagens er særlig velegnet til bestemmelse af proteinkoncentration før og efter koblingsreaktionen, da ingen af stofferne i reaktionen interfererer med farvestoffet kompleksdannelse ved de anvendte koncentrationer. Hvis lavere koncentrationer protein skal anvendes, kan denne metode skulle erstattes af en mere følsom påvisningsmetode dog opmærksomheden skal betales til det faktum, det har at være forenelig med de stoffer, der er indeholdt i koblingsreaktionen. Det anbefales også at bruge frisk fremstillede reagenser og håndtere pulveriserede reagenser med omhu (f.eks butiki en forseglet beholder og bruge silicaperler, for at undgå reagenserne trække fugt) Da kvaliteten af reagenser vil påvirke koblingseffektiviteten. Hvis koblingen effektivitet er lavere end forventet, omfatter mulige løsninger øger de indledende perle og protein koncentrationer. Hvis der bruges højere koncentrationer, koncentrationen af koblingsreagenser skal øges proportionalt for at sikre tilstrækkelig molært overskud. Ændring perle / protein-koncentrationer er normalt en bedre skridt mod optimering snarere end at øge reaktionstider. Da protokollerne for perle kobling er lange, vi almindeligvis forberede et stort parti af materialet. Portioner af suspensionen kan snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -20 ° C i flere måneder. Optøede portioner bør ikke genfryses og skal opbevares ved 4 ° C og anvendes inden for 1-2 dage. Dette vil imidlertid variere med arten og stabiliteten af proteinet anvendt som skal afprøves på et lille parti i første omgang.
<p class = "jove_content"> Bead-koblede adhæsiner kan anvendes til mange anvendelser, som diskuteret nedenfor. Denne protokol beskrives et assay, der er almindeligt anvendt til at måle inhibering af bakteriel binding og patogen-medieret cytotoksicitet på værtsceller. Assayet udføres almindeligvis for at måle kapaciteten af perle-koblet MAMS til kompetitivt at inhibere infektion af Hela epitelceller med havet-fødevarer patogen Vibrio parahaemolyticus, anvendelse af enten et fald i bakteriel vedhæftning til værtsceller eller nedsat cytotoksicitet som udlæsning . I begge tilfælde, forberedelse og kompetitive assays følge samme protokol. Afhængigt af udlæsning, forskellige stammer af V. parahaemolyticus bliver brugt: den cytotoksiske stamme POR1 anvendes for cytotoksicitet målinger, mens de ikke-cytotoksiske stamme POR2 anvendes til måling bakteriel adhæsion, idet celledød og Cellefrigørelse kompromitterer proceduren til kvantificering vedhæftede bakterier.I første omgang, kompe-rencen eksperimenter blev sat op som en trinvis protokol, hvor værtscellerne blev først præinkuberet med perler forud for tilsætningen af bakterier. Til V. parahaemolyticus og perle specifikationer, der anvendes (2 um perler koblet til MAM7), kan både perler og bakterier tilsættes samtidigt uden ændringer i den resulterende cytotoksicitet. Dvs., i dette forsøgsopstilling, perler udkonkurrere bakterier for værtscelle binding. Afhængigt af bakterielle arter og perle geometri, som anvendes, kan der være gode grunde til at bevare perlen adhæsion og bakteriel infektion som to separate trin. For eksempel for at inficere celler med ikke-bevægelige bakterier, pladerne centrifugeres almindeligvis efter tilsætning af infektionen medier. Imidlertid bør centrifugering af plader indeholdende perle suspensioner bør undgås, da dette fører til en meget ujævn fordeling af perlerne på cellelaget. Hvis der bruges mindre partikelstørrelser, vil perler tage længere tid at sætte sig på celleoverfladen, i hvilket tilfælde sufficient tid bør være tilladt for perle fastgørelse forud for infektionen. Når bakteriel adhæsion bruges som en udlæsning, bør der tages prøver på tidspunkter, hvor værtsceller er ikke væsentligt beskadiget af den inficerende stamme, som celle løsrivelse og lyse kan kompromittere kvantificering af vedhæftede bakterier.
I stedet for at optælle bakteriel adhæsion ved fortynding plating, kan prøverne alternativt behandles for imaging (figur 5). I dette tilfælde bør vævskulturceller podes på dækglas, i stedet for direkte i brønde. Derudover kan fluorescerende perler og bakterier, der udtrykker et fluorescerende protein anvendes sammen med infektion-specifikke vært cellemarkører. For eksempel er kompetitive forsøg almindeligvis afbildes under anvendelse af fluorescerende røde rhodamin-phalloidin til farvning værtscellerne 'aktincytoskelettet og vurdere morfologiske ændringer som følge af infektion, sammen med fluorescerende blå perler og fluorescerendegrøn (GFP udtrykke eller SYTO18 farvet) bakterier.
En række perle-koblede adhæsiner, herunder Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD og Vibrio parahaemolyticus MAM, er blevet anvendt som biomimetiske materialer til at studere vedhæftning, adhæsionsinhibering og bidrag adhæsion til patogen-medieret cytotoksicitet 1, 7, 8. En af fordelene ved at anvende denne fremgangsmåde er den lette visualisering af vedhæftede begivenheder, da polymerperler anvendes som scaffolds er tilgængelige i en bred vifte af farver (fx blå, fluorescerende rød, blå, grøn, orange). Således direkte proteinmærkning, hvilket kan forstyrre funktionen, kan undgås. Derudover overflade kobling efterligner multivalente visning af adhesiner på den bakterielle overflade, hvilket afspejler en mere fysiologisk relevant kropsbygning i forhold til opløselige proteiner.
Sammenlignet med undersøgelser ved anvendelse af intakte bakterier eller bacteriAL mutanter, perlen tilgang omgår problemerne forbundet med bakterievækst. For eksempel, på længere sigt (f.eks O / N) undersøgelser af bakteriel adhæsion til værtsceller anvendelse af intakte bakterier er ofte kompromitteret af fænomener ledsager bakterievækst – forsuring af vækstmediet og næringsstof sult negativ indvirkning værtsceller og bakteriereplikation vinder kompromiser billedkvalitet.
For nylig er anvendelsen af perle-koblede adhæsiner blevet udvidet til at omfatte deres anvendelse som værktøjer til affinitet oprensninger af værten cellulære faktorer involveret i signalering processer nedstrøms for bakteriel vedhæftning. V. parahaemolyticus MAM7, via binding til phosphatidsyrer i værtscellemembranen, udløser RhoA aktivering og actin omlejringer 1, 3. MAM-koblede perler bliver brugt til at oprense og identificere proteiner involveret i signalering platforme samles som følge af MAM-værtscelle binding. Da Perlerne kanlet adskilles fra supernatanten ved en kort centrifugeringstrin og proteinet af interesse er kovalent koblet, er dette en god metode til at opnå adskillelse fra kontaminerende proteiner og berige relevante proteinkomplekser, som kan anvendes til efterfølgende anvendelser såsom proteomics eller Western blotting.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.
Reagents | |||
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue – aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose – With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
Penicillin-Streptomycin – Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
PBS | Sigma | D8537 | |
LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
Plasticware | |||
reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
24-well plates | Greiner | 662160 | |
96-well plates | Greiner | 655182 | |
Equipment | |||
haemocytometer | |||
microcentrifuge | |||
plate reader | |||
tissue culture facilities | |||
multichannel pipette |