जीवाणु मेजबान बातचीत विशेषताएँ biomimetic सामग्री
Summary
Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.
Abstract
Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting “bacteriomimetic” materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial – host interactions.
Introduction
Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell’s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions.
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9.
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ, हम क्रमश: amine- को युगल thiol प्रोटीन युक्त करने के लिए इस्तेमाल किया है या कार्बोक्सिलेट संशोधित polystyrene मोती किया जा सकता है, जो दो प्रोटोकॉल, का वर्णन है। कारण प्रक्रिया में आसानी के लिए, thiol-एमाइन युग्मन के लिए बेहतर है, लेकिन वांछित मनका विनिर्देश (व्यास, प्रतिदीप्ति गुण) पर निर्भर करता है, अमाइन-क्रियाशील मोतियों के उपयोग संभव नहीं हो सकता और इसलिए हम कार्बोक्सिलेट परिवर्तित कर देंगे, जो एक प्रोटोकॉल को शामिल किया है – एक amine आधा भाग में शोधकर्ता पाड़ के चुनाव में सबसे बड़ी संभव लचीलापन देने के लिए। प्रोटीन, दिशात्मक युग्मन युक्त किसी भी सिस्टीन के लिए दोनों thiol-एमाइन और thiol-कार्बाक्सिल युग्मन काम (यानी, इसकी एन टर्मिनस प्रति प्रोटीन, सतह प्रदर्शन नकल उतार का स्थिरीकरण) सिस्टीन अवशेषों के बिना एक प्रोटीन की आवश्यकता है, कि जीएसटी संलयन के रूप में उत्पादन किया जाता है प्रोटीन, या उस साइट के द्वारा शुरू की गई एक टर्मिनल सिस्टीन अवशेषों उत्परिवर्तजनन निर्देशित होता है। कई प्रतिक्रियाशील cysteines समाहित कर रहे हैंप्रोटीन के भीतर, इस प्रोटीन समारोह में बाधा हो सकती है, जो बिना सोचे समझे स्थिरीकरण को बढ़ावा मिलेगा। कई बैक्टीरियल adhesins स्वाभाविक रूप से cysteines शामिल नहीं है। इस देशी संरचना और समारोह उत्परिवर्ती में रखा जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए व्यापक assays की आवश्यकता होगी, हालांकि दूसरों के लिए, ये साइट निर्देशित उत्परिवर्तजनन द्वारा हटाया जा सकता है। जीएसटी संलयन प्रोटीन के लिए, मोती करने के लिए मिलकर शुद्ध जीएसटी टैग एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये अक्सर एक साथ पेड़ों का झुरमुट या गैर विशेष कोशिकाओं का पालन करने के लिए एक उच्च प्रवृत्ति के रूप में एक नियंत्रण के रूप में uncoupled मोती का प्रयोग, बचा जाना चाहिए। केवल ईडीसी का उपयोग करने का प्रोटोकॉल 1.2। एक सरलीकृत संस्करण है, इस मामले युग्मन दिशात्मक युग्मन की गारंटी नहीं है इसलिए प्रोटीन में प्राथमिक amines के माध्यम से जगह ले लेता है और फिर भी में, कार्बाक्सिल-क्रियाशील बहुलक मोती युगल प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
एक एजेंट को कम करने के रूप में TCEP ऐसे dithiothr के रूप में अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और आमतौर पर इस्तेमाल एजेंटों को कम करने के साथ बदल नहीं किया जाना चाहिएeitol (डीटीटी) या 2-mercaptoethanol (बीएमई), उनके भीतर निहित thiols thiol-maleimide युग्मन कदम में प्रोटीन युग्मन के साथ प्रतिस्पर्धा करेंगे। पीबीएस अन्य buffers के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन निम्न विचार के साथ: बफ़र प्राथमिक amines में नहीं हो सकता है (ताकि Tris युक्त बफ़र्स उपयुक्त नहीं हैं)। बहुत कम (<10mm) नमक सांद्रता वाले buffers के उपयोग clumping मनका की ओर जाता है और यह भी बचा जाना चाहिए। प्रोटीन पवित्रता भी एक महत्वपूर्ण कारक इस प्रक्रिया के दौरान विचार करने के लिए, और उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए है, शुद्ध प्रोटीन का प्रयोग किया जाना चाहिए। हम नियमित रूप से कम से कम एक समानता शुद्धि और जेल निस्पंदन कदम सहित कई चरणों में प्रोटीन को शुद्ध, लेकिन विनिमय क्रोमैटोग्राफी आयन कुछ मामलों में एक तीसरे कदम के रूप में किया जाता है। एसडीएस पृष्ठ से न्याय के रूप में एक परिणाम के रूप में युग्मन के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन की पवित्रता, आमतौर पर 90% या उससे अधिक है।
यह वीं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रारंभिक प्रतिक्रिया मिश्रण में दोनों प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करने के लिए सिफारिश की हैप्रतिक्रिया पूरा होने के बाद ई सतह पर तैरनेवाला। यह स्पष्ट मनका मिलकर प्रोटीन की एकाग्रता, और इस प्रकार युग्मन घनत्व निर्धारित करने में मदद मिलेगी। दोनों मूल्यों का निर्धारण भी युग्मन दक्षता की गणना के लिए अनुमति देगा। वांछित अंतिम एकाग्रता और युग्मन के घनत्व को प्राप्त करने के लिए, बाद प्रतिक्रियाओं में प्रारंभिक प्रोटीन समाधान तैयार करते समय यह ध्यान में रखा जा सकता है। प्रतिक्रिया में पदार्थों में से कोई भी इस्तेमाल किया सांद्रता में डाई जटिल गठन के साथ हस्तक्षेप के रूप में ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक विशेष रूप से, पहले और युग्मन प्रतिक्रिया के बाद प्रोटीन एकाग्रता के निर्धारण के लिए अनुकूल है। कम प्रोटीन सांद्रता इस्तेमाल हो रहे हैं, तो इस विधि में एक और अधिक संवेदनशील पता लगाने विधि द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, हालांकि ध्यान यह युग्मन प्रतिक्रिया के भीतर निहित पदार्थों के साथ संगत हो गया है इस तथ्य को भुगतान किया जाना है। यह भी देखभाल के साथ पाउडर अभिकर्मकों हौसले से तैयार अभिकर्मकों का उपयोग करें और संभाल करने के लिए सिफारिश की है (उदाहरण के लिए, स्टोरएक मोहरबंद कंटेनर में और सिलिका मोती का उपयोग करें, युग्मन दक्षता को प्रभावित करती है अभिकर्मकों की गुणवत्ता के बाद से नमी ड्राइंग अभिकर्मकों) से बचने के लिए। युग्मन दक्षता अपेक्षा से कम है, तो संभव उपचार प्रारंभिक मनका और प्रोटीन सांद्रता बढ़ शामिल हैं। उच्च सांद्रता का इस्तेमाल किया जा रहा है, युग्मन अभिकर्मकों की एकाग्रता आनुपातिक वृद्धि होने के लिए पर्याप्त दाढ़ अतिरिक्त सुनिश्चित करने के लिए है। मनका / प्रोटीन सांद्रता में संशोधन करना आम तौर पर एक बेहतर अनुकूलन की दिशा में कदम बजाय प्रतिक्रिया समय बढ़ रही है। मनका युग्मन के लिए प्रोटोकॉल लंबा कर रहे हैं, हम आमतौर पर सामग्री की एक बड़ी खेप तैयार करते हैं। निलंबन की aliquots तरल नाइट्रोजन में स्नैप-जमे हुए हैं और कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। Thawed aliquots refrozen नहीं किया जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा और 1-2 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए। बहरहाल, यह शुरू में एक छोटे बैच पर परीक्षण किया जाना चाहिए के रूप में इस्तेमाल प्रोटीन की प्रकृति और स्थिरता के साथ अलग अलग होंगे।
<p clasनीचे चर्चा के रूप में एस = "jove_content"> मनका युग्मित adhesins, कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल आमतौर पर मेजबान कोशिकाओं पर बैक्टीरियल बाध्यकारी और रोगज़नक़ की मध्यस्थता cytotoxicity के निषेध को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक परख का वर्णन किया। परख सामान्यतः कोशिकाओं की मेजबानी के लिए बैक्टीरियल लगाव में कमी या तो उपयोग, प्रतिस्पर्धात्मक रूप समुद्री खाद्य जनित रोगज़नक़ विब्रियो parahaemolyticus साथ हेला उपकला कोशिकाओं के संक्रमण को बाधित करने के लिए मनका युग्मित mams की क्षमता को मापने के लिए किया जाता है या एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में cytotoxicity कम हो जाता है । दोनों ही मामलों में, तैयारी और प्रतियोगिता assays के ही प्रोटोकॉल का पालन करें। वी के readout के आधार पर, विभिन्न प्रकारों parahaemolyticus इस्तेमाल किया जा रहा है: POR1 cytotoxicity मापन के लिए प्रयोग किया जाता है साइटोटोक्सिक तनाव, गैर साइटोटोक्सिक तनाव POR2 बैक्टीरियल आसंजन को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि कोशिका मृत्यु और सेल टुकड़ी संलग्न बैक्टीरिया बढ़ाता के लिए प्रक्रिया समझौता के बाद से।प्रारंभ में, प्रतियोगिताtition प्रयोगों मेजबान कोशिकाओं बैक्टीरिया के अलावा करने से पहले मोतियों के साथ पूर्व incubated पहले थे, जहां एक कदम वार प्रोटोकॉल, के रूप में स्थापित किया गया था। वी के लिए parahaemolyticus और इस्तेमाल मनका विनिर्देशों (MAM7 करने के लिए मिलकर 2 माइक्रोन मोती), दोनों माला और बैक्टीरिया जिसके परिणामस्वरूप cytotoxicity में बदलाव के बिना एक ही समय में जोड़ा जा सकता है। यानी, इस प्रयोगात्मक सेटअप में, मोती मेजबान सेल बाइंडिंग के लिए बैक्टीरिया outcompete। इस्तेमाल किया प्रजातियों के जीवाणु और मनका ज्यामिति पर निर्भर करता है, दो अलग-अलग चरणों के रूप में मनका आसंजन और बैक्टीरिया के संक्रमण को बनाए रखने के लिए अच्छे कारण हो सकता है। उदाहरण के लिए, गैर गतिशील बैक्टीरिया के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, प्लेटें आमतौर पर संक्रमण मीडिया के अलावा के बाद centrifuged हैं। इस सेल परत पर मोतियों का एक बेहद असमान वितरण के लिए होता है लेकिन, जब से मनका निलंबन युक्त प्लेटों की centrifugation, बचा जाना चाहिए। छोटे कण आकार का इस्तेमाल किया जा रहा है, मोती, कोशिका की सतह पर व्यवस्थित करने के लिए लंबे समय तक ले जाएगा, जो मामले सु मेंfficient समय संक्रमण के लिए पहले मनका कुर्की के लिए अनुमति दी जानी चाहिए। बैक्टीरियल आसंजन बाहर पढ़ने के लिए एक के रूप में प्रयोग किया जाता है जब मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित करने में काफी तनाव से क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं, जहां नमूने संलग्न बैक्टीरिया की मात्रा का ठहराव समझौता कर सकते हैं सेल टुकड़ी और सेल के रूप में, समय बिंदुओं पर लिया जाना चाहिए।
इसके बजाय कमजोर पड़ने चढ़ाना द्वारा बैक्टीरियल आसंजन की गणना की, नमूने वैकल्पिक इमेजिंग (चित्रा 5) के लिए कार्रवाई की जा सकती है। इस मामले में, टिशू कल्चर कोशिकाओं बल्कि सीधे कुओं में से, कांच कवर फिसल जाता है पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त फ्लोरोसेंट माला और बैक्टीरिया के संक्रमण-विशिष्ट मेजबान सेल मार्कर के साथ-साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रतियोगिता प्रयोगों आमतौर पर मेजबान कोशिकाओं 'actin cytoskeleton दाग और फ्लोरोसेंट नीले मोती और फ्लोरोसेंट के साथ एक साथ, संक्रमण से उत्पन्न रूपात्मक परिवर्तन का आकलन करने के लिए फ्लोरोसेंट लाल rhodamine-phalloidin का उपयोग imaged हैंहरे (GFP व्यक्त या SYTO18 दाग) बैक्टीरिया।
स्ताफ्य्लोकोच्चुस FnBPA, स्ट्रैपटोकोकस pyogenes एफ 1 FUD और विब्रियो parahaemolyticus एमएएम सहित मनका युग्मित adhesins की एक श्रृंखला, आसंजन, आसंजन निषेध और आसंजन के योगदान का अध्ययन करने के biomimetic माल के रूप में इस्तेमाल किया गया है रोगज़नक़ की मध्यस्थता cytotoxicity 1, 7, 8। मचानों के रूप में इस्तेमाल बहुलक मोती रंग (जैसे, नीले, फ्लोरोसेंट लाल, नीले, हरे, नारंगी) की एक विस्तृत रेंज में उपलब्ध हैं के बाद से इस दृष्टिकोण का उपयोग कर के लाभ में से एक लगाव घटनाओं के दृश्य में आसानी है। इस प्रकार, समारोह के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो प्रत्यक्ष प्रोटीन लेबलिंग, बचा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस प्रकार घुलनशील प्रोटीन की तुलना में एक अधिक physiologically प्रासंगिक रचना को दर्शाती है, युग्मन mimics बैक्टीरियल सतह पर adhesins की multivalent प्रदर्शन सतह।
बरकरार बैक्टीरिया या bacteri का उपयोग अध्ययन की तुलनाअल म्यूटेंट, मनका दृष्टिकोण बैक्टीरिया विकास के साथ जुड़ी समस्याओं में गतिरोध उत्पन्न। नकारात्मक मेजबान कोशिकाओं को प्रभावित मध्यम विकास और पोषक तत्वों की कमी के अम्लीकरण, और बैक्टीरियल प्रतिकृति अंततः समझौता – उदाहरण के लिए, लंबी अवधि (जैसे, हे / एन) बरकरार बैक्टीरिया का उपयोग कोशिकाओं की मेजबानी के लिए जीवाणु आसंजन का अध्ययन अक्सर बैक्टीरिया विकास के साथ घटना के द्वारा समझौता कर रहे हैं इमेजिंग गुणवत्ता।
हाल ही में, मनका-युग्मित adhesins का उपयोग बैक्टीरियल लगाव के बहाव प्रक्रियाओं संकेतन में शामिल मेजबान सेलुलर कारकों की आत्मीयता purifications के लिए उपकरण के रूप में उनके उपयोग शामिल करने के लिए बढ़ा दिया गया है। वी parahaemolyticus MAM7, मेजबान कोशिका झिल्ली में phosphatidic एसिड के लिए बाध्य के माध्यम से, RhoA सक्रियण और actin rearrangements 1, 3 से चलाता है। एमएएम-मिलकर मोती को शुद्ध और एमएएम-मेजबान सेल का एक परिणाम के रूप में इकट्ठा संकेतन प्लेटफार्मों में शामिल प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है बंधन। मोती सकता है, क्योंकिआसानी से एक छोटी centrifugation कदम से सतह पर तैरनेवाला से अलग किया, और ब्याज की प्रोटीन covalently युग्मित है, इस तरह के प्रोटिओमिक्स या वेस्टर्न रूप में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो प्रासंगिक प्रोटीन परिसरों दूषित पदार्थों को प्रोटीन से जुदाई को प्राप्त करने और बेहतर बनाने के लिए एक अच्छा तरीका है, सोख्ता।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.
Materials
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue – aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose – With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin – Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
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