Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.
Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting “bacteriomimetic” materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial – host interactions.
Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell’s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions.
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9.
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.
Heri beskrives to protokoller, som kan brukes til å kople tiol-inneholdende proteiner til amin- eller karboksylat-modifisert polystyren perler, respektivt. På grunn av den lette operasjonsprosess, er tiol-amin kobling å foretrekke, men avhengig av den ønskede perlespesifikasjon (diameter, fluorescens-egenskaper), kan bruk av aminfunksjonaliserte perler ikke være mulig, og vi har derfor tatt en protokoll som vil omdanne karboksylat – inn i en amingruppe for å gi forskeren størst mulig fleksibilitet i valg av stillaset. Selv om begge tiol-amin og tiol-karboksyl kopling verket for ethvert cystein inneholdende protein, retningskopling (dvs. immobilisering av protein per sin N-terminale ende, etterligne overflaten display) krever et protein uten cysteinrester, som er produsert som et GST fusjons protein, eller som inneholder en enkelt terminal cysteinrest innføres ved seterettet mutagenese. Hvis flere reaktive cysteiner finnesinnenfor proteinet, vil dette føre til tilfeldige immobilisering noe som kan hindre proteinfunksjon. Mange bakterielle adhesiner ikke inneholder cysteiner naturlig. For andre, kan disse fjernes ved hjelp av seterettet mutagenese, selv om dette ville kreve omfattende prøver for å sikre opprinnelige struktur og funksjon er beholdt i mutant. For GST fusjonsproteiner, kan renset GST-tag koblet til kulene skal brukes som et passende negativ kontroll. Ved hjelp av koblede perler som en kontroll bør unngås, da disse ofte har en høyere tendens til å klumpe seg sammen eller holde celler ikke-spesifikt. En forenklet versjon av protokollen 1.2., Ved å bruke kun EDC, kan brukes til å kople proteiner til karboksyl-funksjonaliserte polymerperler, men i dette tilfelle koplingen skjer ved hjelp av primære aminer på proteinet og således garanterer ikke rettet kobling.
TCEP som reduksjonsmiddel må ikke erstattes med andre kommersielt tilgjengelige, og som vanligvis anvendes reduksjonsmidler, som for eksempel dithiothreitol (DTT) eller 2-merkaptoetanol (BME), som tioler som finnes i dem vil konkurrere med protein kopling i tiol-maleimid koblingstrinn. PBS kan erstattes med andre buffere, men med de følgende betraktninger: Buffere kan ikke inneholde primære aminer (så Tris-inneholdende buffere er ikke egnet). Bruk av buffere som inneholder meget lave (<10 mm) saltkonsentrasjoner fører til bead klumpdannelse, og bør også unngås. Protein renhet er også en viktig faktor å vurdere i løpet av denne fremgangsmåten, og for å oppnå data av høy kvalitet, bør rene proteiner brukes. Vi rutinemessig rense proteiner i flere trinn, innbefattende minst en affinitetsrensing og gel-filtreringstrinn, men i noen tilfeller ionebyttekromatografi er gjort som et tredje trinn. Som et resultat av renheten av proteiner som brukes for koblingen er vanligvis 90% eller høyere, som bedømt ved SDS-PAGE.
Det anbefales å bestemme proteinkonsentrasjonene både i den initiale reaksjonsblanding, så vel som av the supernatanten etter ferdig reaksjon. Dette vil bidra til å bestemme den tilsynelatende konsentrasjon av perle-koblet protein, og dermed koblings tetthet. Bestemmelse av begge verdier vil også tillate beregning av koblingseffektiviteten. Dette kan tas hensyn til ved fremstilling av den innledende proteinoppløsningen i etterfølgende reaksjoner, for å oppnå den ønskede sluttkonsentrasjon og kobling tetthet. Bradford-reagens er spesielt egnet for bestemmelse av proteinkonsentrasjon før og etter koblingsreaksjonen, da ingen av stoffene i reaksjonen forstyrrer fargestoff kompleksdannelsen ved de konsentrasjoner som benyttes. Dersom lavere proteinkonsentrasjoner som skal brukes, kan denne fremgangsmåten har til å bli erstattet av en mer sensitiv deteksjonsmetode, men hensyn må tas hensyn til det faktum at det må være forenlig med de stoffer som inneholdes i koblingsreaksjonen. Det anbefales også å bruke nylagde reagenser og håndtere pulveriserte reagenser med forsiktighet (for eksempel butikki en lukket beholder og anvende silikakuler, for å unngå reagensene tegningen fuktighet) siden kvaliteten av reagenser vil påvirke koblingseffektiviteten. Dersom koblingsgraden er lavere enn forventet, inkluderer mulige løsninger øker de innledende perle og proteinkonsentrasjoner. Ved høyere konsentrasjoner blir brukt, har konsentrasjonen av koblingsreagenser økes proporsjonalt for å sikre tilstrekkelig molart overskudd. Modifisere perle / proteinkonsentrasjonen er vanligvis et bedre skritt mot optimalisering stedet for å øke reaksjonstider. Siden protokollene for vulsten kopling er lange, vi vanligvis forberede en stor sats av materialet. Porsjoner av suspensjonen kan snap-frosset i flytende nitrogen og lagret ved -20 ° C i flere måneder. Tinte alikvoter bør ikke fryses på nytt og må holdes ved 4 ° C og anvendt i løpet av 1-2 dager. Dette vil imidlertid variere med typen og stabiliteten av proteinet brukes som skal testes på et lite parti i utgangspunktet.
<p class = "jove_content"> Bead-koplede adhesiner kan brukes i mange anvendelser, slik som omtalt nedenfor. Denne protokollen beskrevet en metode som vanligvis brukes til å måle hemming av bakteriell binding og patogen-mediert cytotoksisitet på vertsceller. Analysen blir vanligvis utført for å måle kapasiteten på perle-coupled Mams til kompetitivt hemme infeksjon av Hela epitelceller med sjø-matbårne patogene Vibrio parahaemolyticus, enten ved hjelp av en nedgang i bakterie vedlegg til vertsceller eller redusert cytotoksisitet som en skrive ut . I begge tilfeller, forberedelse og kompetitive analyser følge den samme protokoll. Avhengig av avlesning, ulike stammer av V. parahaemolyticus blir brukt: den cytotoksiske stammen POR1 brukes for cytotoksisitets-målinger, mens de ikke-cytotoksiske stamme POR2 benyttes for måling av bakteriell adhesjon, ettersom celledød og celle løsgjøring kompromisser fremgangsmåten for kvantifisering festet bakterier.Utgangspunktet, komperanse forsøk ble satt opp som en trinnvis protokoll, hvor vertscellene ble først pre-inkubert med perler før tilsetningen av bakterier. For V. parahaemolyticus og perle spesifikasjoner som brukes (2 mikrometer perler koblet til MAM7), kan både perler og bakterier legges samtidig uten endringer i den resulterende cytotoksisitet. Dvs, i dette eksperimentelle oppsettet, perler utkonkurrere bakterier for vertscelle bindende. Avhengig av bakteriearter og kulegeometri brukes, kan det være gode grunner for å opprettholde vulsten adhesjon og bakteriell infeksjon som to separate trinn. For eksempel, for å infisere celler med ikke-motile bakterier, blir platene vanligvis sentrifugert etter tilsetning av infeksjonen media. Imidlertid bør sentrifugering av plater inneholdende kulesuspensjoner bør unngås, da dette fører til en meget ujevn fordeling av perler på cellelaget. Hvis mindre partikkelstørrelser blir brukt, vil perler ta lengre tid å slå seg ned på celleoverflaten, i så fall sufficient tid bør være tillatt for perle vedlegg før infeksjonen. Når bakteriell adhesjon blir brukt som en lest ut, må prøvene tatt ved punktene hvor vertsceller som ikke er vesentlig skadet av den infiserende stamme, som cellelysering og løsgjøring kan kompromittere kvantifisering av vedlagte bakterier.
I stedet for opplisting bakteriell adhesjon ved fortynning plettering, kan prøvene eventuelt behandles for imaging (figur 5). I dette tilfellet bør vevskultur-cellene sådd ut på glass dekkglass, i stedet for direkte inn i brønnene. I tillegg kan fluorescerende kuler og bakterier som uttrykker et fluorescent protein bli brukt, sammen med smitte-spesifikke vertscellemarkører. For eksempel er konkurranse eksperimenter ofte avbildes med fluoriserende rød rhodamin-phalloidin å farge vertscellenes aktin cytoskjelettet og vurdere morfologiske endringer som følge av infeksjon, sammen med fluorescerende blå perler og fluorescerendegrønn (GFP uttrykke eller SYTO18 farget) bakterier.
En rekke kule-koplet adhesiner, deriblant Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD og Vibrio parahaemolyticus MAM, har blitt brukt som biomimetic materialer for å studere adhesjon adhesjon inhibering og bidraget av adhesjonen til patogen-mediert cytotoksisitet 1, 7, 8. En av fordelene med å bruke denne tilnærmingen er den enkle visualisering av festearrangementer, ettersom polymerperlene som benyttes som stillas er tilgjengelige i et bredt spekter av farger (for eksempel blå, fluoriserende rød, blå, grønn, orange). Således protein direkte merking, noe som kan forstyrre funksjonen, kan unngås. I tillegg er overflaten koblingsetterligner det flerverdige visningen av adhesiner på bakterieoverflaten, således reflekterer en mer fysiologisk relevant konformasjon i forhold til oppløselige proteiner.
Sammenlignet med studier med intakte bakterier eller bacterial mutanter, omgår vulsten tilnærmingen problemene forbundet med bakterievekst. For eksempel, lengre sikt (f.eks, O / N) studier av bakteriell adhesjon til vertsceller ved bruk av intakte bakterier ofte er kompromittert av fenomener tilhørende bakterievekst – surgjøring av vekstmediet og næringsutarming negativt påvirke vertsceller, og bakteriell replikasjon slutt kompromitterer bildekvalitet.
Mer nylig er bruk av kule-koplet adhesiner blitt utvidet til å omfatte deres anvendelse som verktøy for affinitets-rensinger av vertscelle faktorer involvert i signaleringsprosesser nedstrøms av bakteriell festing. V. parahaemolyticus MAM7, via binding til fosfatidinsyre syrer i vertscellemembran, utløser RhoA aktivering og actin rearrangementer 1, 3. MAM-koplet perler blir brukt til å rense og identifisere proteiner som er involvert i signaleringsplattformene montert som en konsekvens av MAM-vertscelle bindende. Siden perler kanlett bli separert fra supernatanten ved en kort sentrifugeringstrinn, og proteinet av interesse er kovalent bundet, er dette en god metode for å oppnå separasjon av forurensende proteiner og berike relevante proteinkomplekser, som kan brukes til nedstrøms applikasjoner som proteomforskning eller Western blotting.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.
Reagents | |||
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue – aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose – With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
Penicillin-Streptomycin – Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
PBS | Sigma | D8537 | |
LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
Plasticware | |||
reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
24-well plates | Greiner | 662160 | |
96-well plates | Greiner | 655182 | |
Equipment | |||
haemocytometer | |||
microcentrifuge | |||
plate reader | |||
tissue culture facilities | |||
multichannel pipette |