Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.
Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting “bacteriomimetic” materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial – host interactions.
Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell’s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions.
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9.
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.
Häri beskriver vi två protokoll, som kan användas för att koppla tiolinnehållande proteiner till amin- eller karboxylat-modifierade polystyrenkulor, respektive. På grund av att underlätta förfarandet, är tiol-aminkoppling föredra, men beroende på önskad pärla specifikation (diameter, fluorescensegenskaper) kan användning av aminfunktionaliserade pärlorna inte vara möjligt och vi har därför inkluderat ett protokoll som kommer att konvertera karboxylat – i en amingrupp för att ge forskaren största möjliga flexibilitet i valet av byggnadsställning. Även om både tiol-amin och tiol-karboxyl kopplings verk för alla cystein innehållande protein, riktningskoppling (dvs immobilisering av proteinet per dess N-terminal, imitera ytpresentation) kräver ett protein utan cysteinrester, är den som produceras som ett GST-fusions protein eller som innehåller en enda terminal cysteinrest infördes genom riktad mutagenes. Om flera reaktiva cysteiner ingårinom proteinet, kommer detta att leda till slumpmässiga immobilisering som kan hindra proteiners funktion. Många bakteriella adhesiner inte innehåller cysteiner naturligt. För andra kan dessa avlägsnas genom ställesriktad mutagenes, även om detta skulle kräva omfattande analyser för att säkerställa nativ struktur och funktion bibehålls i mutanten. För GST-fusionsproteiner, kan renade GST-taggen kopplad till pärlor användas som en lämplig negativ kontroll. Använda okopplade pärlor som en kontroll bör undvikas, eftersom dessa har ofta en större tendens att klumpa ihop sig eller vidhäfta till celler ospecifikt. En förenklad version av protokollet 1,2., Med användning av endast EDC, kan användas för att koppla proteiner till karboxyl-funktionaliserad polymerpärlor, men i detta fall koppling sker via primära aminer i proteinet och därför garanterar inte riktningskoppling.
TCEP som reduktionsmedel får inte ersättas med andra kommersiellt tillgängliga och vanligen använda reduktionsmedel, såsom dithiothreitol (DTT) eller 2-merkaptoetanol (BME), eftersom tioler som finns i dem kommer att konkurrera med proteinkoppling i tiol-maleimid kopplingssteg. PBS kan ersättas med andra buffertar, men med följande överväganden: Buffertar får inte innehålla primära aminer (så Tris-innehållande buffertar är inte lämpliga). Användning av buffertar som innehåller mycket låga (<10 mM) saltkoncentrationer leder till pärla klumpar och bör också undvikas. Protein renhet är också en viktig faktor att beakta under detta förfarande, och för att uppnå högkvalitativa data, bör rena proteiner användas. Vi rena rutinmässigt proteiner i flera steg, innefattande åtminstone en affinitetsrening och gelfiltreringssteg, men i vissa fall Jonbyteskromatografi sker som ett tredje steg. Som ett resultat renheten av proteiner som används för koppling är vanligen 90% eller högre, såsom bedömdes genom SDS-PAGE.
Det rekommenderas att bestämma proteinkoncentrationer både i den ursprungliga reaktionsblandningen liksom the supernatanten efter reaktionens fullbordan. Detta kommer att hjälpa till att avgöra den skenbara koncentrationen av pärla-kopplat protein, och därmed kopplingstäthet. Bestämning av båda värdena kommer också att möjliggöra beräkning av kopplingseffektiviteten. Detta kan tas i beaktande vid utarbetandet av den initiala proteinlösningen i efterföljande reaktioner, för att uppnå den önskade slutkoncentrationen och kopplingsdensitet. Bradford reagens är speciellt lämpad för bestämning av proteinkoncentration före och efter kopplingsreaktionen, eftersom inget av de ämnen i reaktionen stör färgämnet komplexbildning vid de koncentrationer som används. Om lägre proteinkoncentrationer som skall användas, kan denna metod måste ersättas med en mer känslig detektionsmetod, uppmärksamhet måste dock tas till det faktum att det måste vara kompatibla med de ämnen som finns i kopplingsreaktionen. Det rekommenderas också att använda nylagade reagenser och hantera pulver reagens med omsorg (t.ex. lagrai en sluten behållare och använda kiseldioxidpärlor, för att undvika reagensen ritning fukt) Eftersom kvaliteten på reagensen kommer att påverka kopplingseffektiviteten. Om kopplingseffektiviteten är lägre än väntat, bland annat eventuella åtgärder ökar de initiala pärla och proteinkoncentrationer. Om högre koncentrationer används, har koncentrationen av kopplingsreagens ökas proportionellt för att säkerställa tillräcklig molärt överskott. Ändra pärla / proteinkoncentrationer är oftast ett bättre steg mot optimering snarare än att öka reaktionstider. Eftersom protokollen för pärla koppling är lång, vi förbereda vanligtvis en stor sats av material. Alikvoter av suspensionen kan snabbfrystes i flytande kväve och lagrades vid -20 ° C under flera månader. Tinade portioner bör inte frysas och bör hållas vid 4 ° C och användas inom 1-2 dagar. Detta kommer dock att variera med naturen och stabiliteten hos proteinet som ska testas på en liten sats från början.
<p class = "jove_content"> Bead-kopplade adhesiner kan användas för många tillämpningar, såsom diskuteras nedan. Detta protokoll beskrivs en analys som vanligen används för att mäta inhibering av bakteriell bindning och patogen-medierad cytotoxicitet på värdceller. Analysen utförs vanligen för att mäta kapaciteten hos däckfotskopplade mams att kompetitivt inhibera infektion av Hela-epitelceller med havet-foodborne patogen Vibrio parahaemolyticus, med användning av antingen en minskning i bakteriell vidhäftning till värdceller eller reducerad cytotoxicitet som en utläsning . I båda fallen, förberedelse och konkurrensanalyser följa samma protokoll. Beroende på avläsning, olika stammar av V. parahaemolyticus används: den cytotoxiska stammen POR1 används för cytotoxicitet mätningar, medan den icke-cytotoxiska stam POR2 används för mätning bakteriell vidhäftning, eftersom celldöd och cell lossnar äventyrar det förfarande för kvantifiering av bundna bakterier.Initialt konkurrens experiment sattes upp som en stegvis protokoll, där värdceller var första förinkuberades med pärlor före tillsats av bakterier. För V. parahaemolyticus och pärla specifikationer som används (2 pm pärlor kopplade till MAM7), kan både pärlor och bakterier tillsättas samtidigt utan ändringar i den resulterande cytotoxicitet. Dvs, i denna experimentuppställning, pärlor konkurrerar bakterier värdcellbindning. Beroende på bakteriearter och pärla geometri som används, kan det finnas goda skäl för att upprätthålla pärla vidhäftning och bakterieinfektion som två separata steg. Till exempel, för att infektera celler med icke-rörliga bakterier, plattorna vanligen centrifug efter tillsats av infektionen media. Emellertid bör centrifugering av plattor innehållande pärlor suspensioner undvikas, eftersom detta leder till en mycket ojämn fördelning av pärlorna på cellskiktet. Om mindre partikelstorlekar används, kommer kulorna att ta längre tid att sätta sig på cellytan, i vilket fall SUfficient tid bör tillåtas för pärla fastsättning före infektionen. När bakteriell vidhäftning används som läste upp, bör prover tas vid tidpunkter där värdceller inte signifikant skadas av den infekterande stammen, som cell lossnar och lys kan äventyra kvantifiering av bifogade bakterier.
I stället för att räkna bakteriell vidhäftning av utspädningsplatt, kan proverna alternativt behandlas för avbildning (Figur 5). I detta fall bör vävnadsodlingsceller sås på täckglas, snarare än direkt i brunnar. Dessutom kan fluorescerande pärlor och bakterier som uttrycker ett fluorescerande proteinet användas tillsammans med infektionsspecifika värdcellmarkörer. Till exempel är konkurrensexperiment vanligen avbildas med fluorescerande röd rodamin-falloidin att färga värdcellerna "aktincytoskelettet och utvärdera morfologiska förändringar till följd av infektion, tillsammans med fluorescerande blå pärlor och fluorescerandegrön (GFP-uttryckande eller SYTO18 färgad) bakterier.
En rad bead kopplade adhesiner, inklusive Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD och Vibrio parahaemolyticus MAM, har använts som biomimetiska material för att studera adhesion, vidhäftning hämning och bidraget från vidhäftning till patogen-medierad cytotoxicitet 1, 7, 8. En av fördelarna med att använda detta tillvägagångssätt är den enkla visualisering av fäst händelser, eftersom polymerpärlorna som används som byggnadsställningar är tillgängliga i en mängd olika färger (t.ex. blå, fluorescerande röd, blå, grön, orange). Sålunda direkt proteinmärkning, som kan störa funktionen, kan undvikas. Dessutom ytan kopplings härmar värda visning av adhesiner på bakterieytan, vilket återspeglar en mer fysiologiskt relevant konforma jämfört med lösliga proteiner.
Jämfört med studier med intakta bakterier eller bacterial-mutanter, kringgår pärlan strategi problem som är förknippade med bakterietillväxt. Till exempel, på längre sikt (t.ex. O / N) studier av bakteriell vidhäftning till värdceller med hjälp av intakta bakterier ofta äventyras av fenomen som åtföljer bakterietillväxt – försurning av tillväxtmediet och näringsämnen utarmning påverkar värdceller negativt, och bakteriell replikering äventyrar slutligen bildkvalitet.
På senare tid har användningen av pärla kopplade adhesiner utvidgats till att omfatta deras användning som verktyg för affinitets reningar av värd cellulära faktorer som signalprocesser nedströms bakteriell vidhäftning. V. parahaemolyticus MAM7, via bindning till fosfatidinsyror i värdcellmembranet, utlöser RhoA aktivering och aktin omlagringar 1, 3. MAM kopplade pärlorna används för att rena och identifiera proteiner som är involverade i signaleringsplattformar hopsatta som en konsekvens av MAM-värdcell bindande. Eftersom pärlor kanlätt separeras från supernatanten genom en kort centrifugeringssteg, och proteinet av intresse kovalent, är detta en bra metod för att uppnå separation från förorenande proteiner och berika relevanta proteinkomplex, som kan användas för tillämpningar efter såsom proteomik eller västra Blotting.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.
Reagents | |||
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue – aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose – With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
Penicillin-Streptomycin – Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
PBS | Sigma | D8537 | |
LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
Plasticware | |||
reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
24-well plates | Greiner | 662160 | |
96-well plates | Greiner | 655182 | |
Equipment | |||
haemocytometer | |||
microcentrifuge | |||
plate reader | |||
tissue culture facilities | |||
multichannel pipette |