Here we present methodology for the production of a focal stroke in murine white matter by local injection of an irreversible endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor (L-Nio). Presented are two stereotactic variations, retrograde neuronal tracing, and fresh tissue labeling and dissection that expand the potential applications of this technique.
Stroke drabbar vita substansen står för upp till 25% av kliniska stroke presentationer sker tyst vid hastigheter som kan vara 5-10 gånger högre, och bidrar i hög grad till utvecklingen av vaskulär demens. Några modeller av fokal vit substans stroke finns och denna brist på lämpliga modeller har hämmat förståelsen av de neurobiologic mekanismer som är involverade i skador respons och reparation efter denna typ av stroke. Den största begränsningen av andra subkortikala stroke modeller är att de inte fokalt begränsar infarkten till den vita substansen eller har huvudsakligen validerats i icke-murina arter. Detta begränsar förmågan att tillämpa den breda variationen av murina forskningsverktyg för att studera neurobiologi vita substansen stroke. Här presenterar vi en metod för tillförlitlig produktion av en fokal stroke hos mus vit substans med hjälp av en lokal injektion av en irreversibel eNOS-hämmare. Vi presenterar också flera varianter på det allmänna protokollet inklusive två unik stereotaktiskvariationer, bakåtsträvande neuronala spårning, liksom färsk vävnad märkning och dissekering som kraftigt utöka de potentiella tillämpningar av denna teknik. Dessa variationer tillåter flera metoder för att analysera neurobiologic effekterna av denna gemensamma och understudied form av stroke.
Stroke affecting the subcortical white matter is a common clinical entity, accounting for up to 25% of clinical strokes annually in the US 1. Ischemic damage to white matter also occurs silently at a significantly higher rate and contributes to the development of vascular dementia 2,3. Presently, patients with this form of cerebral ischemia have few, if any treatment choices. Despite the clinical importance of this disease, few clinically relevant animal models exist 4,5.
The goal of this protocol is to produce a focal ischemic lesion within the murine white matter. This murine model of human disease allows the specific study of axonal injury response to stroke and how the cellular elements of white matter, namely oligodendrocytes and astrocytes along with axons, respond to and repair after stroke.
Previous reports have described a model of subcortical white matter stroke using endothelin-1 (ET-1) 6 that is similar to the one described here. Several key changes to the experimental protocol have been made thereby the potential uses of this model have expanded 7,8. This protocol provides a reliable and modifiable strategy to produce a focal stroke within mouse brain white matter.
The major advantages of this model are the use of a chemical endothelial nitric oxide synthase (eNOS) inhibitor N(5)-(1)-iminoethyl-L-ornithine HCl (L-Nio) 9 with no known paracrine effects on cellular elements of white matter which had been a complication of models using endothelin-1 10. In addition, the stereotactic targeting of white matter in the mouse allows the use of any variety of transgenic or knockout strains, greatly expanding the available tools to determine the effect of stroke on brain white matter. Here, two variations on this technique are described and demonstrate some of the additional variations that can be utilized to enhance the understanding of axonal and white matter damage and repair after stroke.
Ett antal tidigare modeller av subkortikal stroke har beskrivits inkluderande fokala injektioner av endotelin-1 i den inre kapseln, subkortikal vit substans och striatum på råtta 12-14 och mus 6,15. Nyare modeller av små kontaktpunkter stroke har utnyttjat kolesterol microemboli injektion i halspulsådern 16 och photothrombotic ocklusion av en enda genomträngande arteriole 17. Var och en av dessa modeller har både fördelar och nackdelar 5. Den nu beskrivna mod…
The authors have nothing to disclose.
SN och MDD fick stöd från NIH K08 NS083740 och UCLA Department of Neurology. AJG erkänner stöd från Dr. Miriam och Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation och Larry L. Hillblom Foundation. KLN erkänner tacksamt stöd från American Heart Association 14BFSC17760005 ASA-Bugher Stroke Center. ILL, EGS och STC stöddes av NIH R01 NS071481. JDH erkänner stöd från NIH K08 NS083740.
L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride | Calbiochem | 400600-20MG | |
Isoflurane | Phoenix Pharmaceutical, Inc. | NDC 57319-559-06 | |
Capillary tubes | World Precision Instruments | 50-821-807 | |
Picospritzer | Parker Instrumentation | Picospritzer II | |
Stereotactic setup | Kent Scientific | KSC51725 | |
Pipette puller | KOPF | Model 720 | |
Stereomicroscope SZ51 | Olympus | 88-124 | |
Fine scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | |
Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8547 | |
Curved Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8598 | |
Blunt dissection tool | Fine Scientific Tools | 10066-15 | |
Drill | Dremel | 8220-1/28 | |
Drill bits | Fine Scientific Tools | 19007-05 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Marcaine | HOSPIRA | NDC 0409-1610-50 | |
Trimethoprim-Sulfamethaxole | STI Pharmacy | NDC 54879-007-16 | |
Fluororuby | Fluorochrome Inc | 30mg | |
Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | |
Sucrose | Fisher | BP220-10 | |
Cryostat | Leica CM3050 S | 14047033518 | |
Glass slides | Fisher | 12-544-7 | |
Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
Dissection microscope | Nikon | SMZ1500 | |
23 gauge butterfly needle | Fisher | 14-840-35 | |
10X Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14065056 | |
1M HEPES-KOH, pH 7.4 | Affymetrix | 16924 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
Cyclohexamide | Sigma | 01810 |