Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l'évaluation de l'interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes
Summary
This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.
Abstract
Les bactéries anaérobies sont beaucoup plus nombreux aérobies dans de nombreuses niches humaines telles que l'intestin, de la bouche et le vagin. En outre, les infections anaérobies sont fréquents et souvent d'origine indigène. La capacité de certains agents pathogènes anaérobies à envahir les cellules humaines leur donne des mesures d'adaptation pour échapper à l'immunité innée, ainsi que pour moduler le comportement de la cellule hôte. Cependant, veiller à ce que les bactéries anaérobies sont en direct pendant l'enquête expérimentale des événements peuvent poser des problèmes. Porphyromonas gingivalis, un anaérobie à Gram négatif, est capable d'envahir une variété de cellules non-phagocytaires eucaryotes. Cet article décrit comment réussir à la culture et d'évaluer la capacité de P. gingivalis à envahir les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Deux protocoles ont été développés: de mesurer les bactéries qui peuvent survivre avec succès envahir et à l'intérieur de l'hôte, et l'autre pour visualiser les bactéries qui interagissent avec les cellules hôtes. Ces techniques nécessitent l'utilisation d'un anaechambre pour fournir P. Robic gingivalis avec un milieu anaérobie pour une croissance optimale.
Le premier protocole est basé sur le test de protection aux antibiotiques, qui est largement utilisé pour étudier l'invasion des cellules hôtes par des bactéries. Toutefois, l'essai de protection antibiotique est limité; seules les bactéries intracellulaires qui sont cultivables et après un traitement antibiotique de lyse de la cellule hôte sont mesurées. Pour évaluer toutes les bactéries interagissent avec les cellules hôtes, à la fois vivants et morts, nous avons développé un protocole qui utilise la microscopie à fluorescence pour examiner l'interaction hôte-pathogène. Les bactéries sont marquées par fluorescence avec la 2 ', 7'-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et-6) -carboxyfluorescéine acétoxyméthyl ester (BCECF-AM) et utilisé pour infecter des cellules eucaryotes dans des conditions anaérobies. Suite à la fixation avec du paraformaldehyde et perméabilisation avec 0,2% de Triton X-100, les cellules hôtes sont marqués avec DAPI et TRITC phalloïdine pour marquer le cytosquelette de la cellule et du noyau, respectivement. Multiple images prises à différents points focaux (Z-Stack) sont obtenus pour la visualisation spatio-temporelle des bactéries. Les méthodes utilisées dans cette étude peuvent être appliqués à n'importe quel anaérobie cultivable et n'importe quel type de cellule eucaryote.
Introduction
Les bactéries anaérobies colonisent presque toutes les surfaces du corps humain. Bien prédominant dans la flore intestinale des voies génito-urinaires et où les concentrations d'oxygène sont faibles, ils existent également à des niveaux élevés sur la peau, de la bouche, du nez et de la gorge 1. Les bactéries anaérobies sont une cause fréquente d'infections endogènes et sont fréquemment isolés à partir de sites malades. Toutefois, en raison de leur nature fastidieuse, anaérobies peuvent être difficiles à isoler et à la culture. Les études portant sur les bactéries anaérobies doivent être effectuées dans des conditions restreintes. Techniques anaérobie-culture moderne permettent aux chercheurs d'imiter les paramètres anaérobies nécessaires à l'étude de nombreuses souches de laboratoire anaérobie ou même des isolats cliniques 2,3.
Des bactéries anaérobies pathogènes ont développé une relation dynamique et co-évolution avec les cellules de l'hôte dans lequel ils résident. La plupart des bactéries anaérobies sont sensibles à la destruction par la réponse immunitaire de l'hôte avant d'atteindre infectiniveaux UO. Cependant, certaines bactéries pathogènes ont développé des mécanismes pour échapper à ou dénaturer la réponse immunitaire de l'hôte. Ils atteindre cet objectif par le biais de mécanismes tels que l'évasion de la reconnaissance immunitaire, neutralisation des médiateurs immunitaires, l'altération de l'immunité à médiation cellulaire, l'invasion des cellules hôtes, et la modification de la signalisation 4 immunitaire. Porphyromonas gingivalis, un anaérobie à Gram négatif impliquées à la fois orale et maladies, extra- est un exemple d'un agent pathogène bactérien très adapté capable de provoquer des changements pathogènes chez l'hôte 7.5.
Des poches de la plaque de biofilm courus dans de profondes crevasses formées entre les dents et le tissu muqueux gingival peuvent abriter des bactéries anaérobies qui sont protégés de l'oxygène atmosphérique 8. Ces poches parodontales servir de niche de divers agents pathogènes anaérobies, telles que P. 9 gingivalis. P. gingivalis est un agent pathogène de la distorsion qui est capable de remodelering la communauté microbienne buccale de manière à promouvoir le développement et la progression des maladies parodontales 10. Elle produit un grand nombre de facteurs de virulence qui sont actifs contre un large spectre de protéines de l'hôte et fournit des mécanismes pour l'évasion de 11 défenses de l'hôte. Il est également capable d'envahir épithéliales, endothéliales, fibroblastes et les cellules du ligament parodontal in vitro et in vivo de 12 à 14 15. En envahissant efficacement les cellules de l'hôte, P. gingivalis peut échapper à l'immunité de l'hôte. Invasion efficace de cellules hôtes non seulement permet à la bactérie de se échapper défenses de l'hôte, mais sert également de réservoir pour l'avenir ré-infection ainsi que modifie la cellule hôte. Des études sur les mécanismes moléculaires impliqués dans l'adhésion et l'internalisation de la bactérie par des cellules hôtes sont nécessaires. Recherche dans plusieurs laboratoires se concentre sur la compréhension des événements moléculaires associés à l'internalisation de P. gingivalis par les cellules hôtesainsi que les mécanismes utilisés pour réprimer et détourner la réponse immunitaire et survivre aux mécanismes de défense de l'hôte hostiles.
Il existe de nombreux dosages capables d'identifier et de caractériser des agents pathogènes qui sont capables d'envahir les cellules hôtes. Cependant, des études in vitro avec des agents pathogènes anaérobies posent de nombreux problèmes expérimentaux pour le chercheur, principalement parce qu'il est difficile de réaliser des études qui reposent sur des instruments encombrants en l'absence d'oxygène. Cette situation est aggravée par le fait que les cellules eucaryotes besoin d'oxygène pour se développer et doivent donc être préparés séparément dans des incubateurs de culture de tissus. Une façon d'éviter ces obstacles serait d'effectuer les études sous oxygène atmosphérique, mais ce serait faire de la croissance de bactéries anaérobies impossible. Une autre méthode serait d'utiliser des bactéries tuées par la chaleur à infecter et à étudier les interactions de la cellule hôte. Cependant, des différences existent entre les bactéries tuées par la chaleur et viables qui diminuent la pertinence de la interacti hôte-pathogènele 16. Il est central pour étudier les bactéries viables avec l'expression inchangé interagir avec des cellules hôtes; par conséquent, des procédés pour cultiver P. gingivalis dans un cadre anaérobie sont donnés. En outre, deux protocoles rentables simples sont démontrées pour évaluer la capacité de P. gingivalis à être internalisée par les cellules humaines ombilicales veineuses endothéliales (HUVEC). Le premier protocole est basé sur le dosage de protection populaire antibiotique. Bien que le test est simple, les considérations lors de l'utilisation de micro-organismes anaérobies sont donnés. Le deuxième protocole nécessite l'utilisation d'un microscope à fluorescence à balayage visualiser et interagir internalisé P. gingivalis. Chaque test a ses limites et avantages qui seront discutés de fournir au chercheur un aperçu pour l'étude de l'envahissement de bactéries anaérobies. Bien que le manuscrit en cours étudie P. gingivalis et HUVECs, ces protocoles peuvent être utilisés pour de nombreuses autres bactéries anaérobies ainsique pour les autres types de cellules hôtes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tous les procédés ci-dessus peuvent être utilisées pour concevoir des dosages spécifiques pour évaluer l'interaction entre les bactéries anaérobies avec des cellules eucaryotes. Cependant, il ya plusieurs considérations à effectuer avec succès les expériences. D'abord, les souches microbiennes à être utilisés dans une étude.
Il est essentiel dans la comparaison des deux souches à la fois le test de survie, ainsi que par une analyse par microscopie qu'ils sont à …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).
Materials
| Vinyl Anaerobic Chamber-Type B | Coy Laboratory Products | Model 2000 incubator | |
| TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood | BBL | 221261 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponin | Riedel-de Haen | 16109 | |
| Gentamicin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm Circular Coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| VectaShield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
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