Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D

Summary

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Abstract

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

Introduction

È accertato che la motilità delle cellule tumorali è predittiva di potenziale metastatico, dato che tale comportamento facilita l'invasione attraverso la membrana basale e l'ingresso nel sistema circolatorio ^1. Maggior parte delle ricerche sulla motilità si è concentrata su come le cellule si comportano in un ambiente bidimensionale (2D), anche se sta diventando ampiamente riconosciuto che il movimento delle cellule in una tridimensionale (3D) matrice è più rappresentativo di come queste stesse cellule saranno effettivamente comportarsi in vivo ^2. Sistemi di coltura 3D sono sempre più utilizzati per studiare i comportamenti cellulari che vanno dalla morfologia delle cellule, di cinetica di crescita e sensibilità ai farmaci ^3. Il desiderio di controllare l'invasione delle cellule del cancro nel contesto di un ambiente 3D ha portato alla sintesi di tecniche precedentemente stabilito che comportano la generazione di aggregati di cellule 3D (sferoidi) tramite il metodo di coltura goccia pendente ^4, seguita da incorporare questi sferoidi in un extracellulare 3D matrice (ECM), composto di collagene e membrana basale materiali ^5. Questo metodo cerca di migliorare queste tecniche precedentemente stabiliti fornendo un approccio semplificato che può essere facilmente utilizzato per confrontare invasione sotto una varietà di condizioni sperimentali.

Altri modi tradizionali per valutare la motilità cellulare in vitro sono il saggio di graffi ferita e il dosaggio transwell ^6. Il primo test raffigura motilità cellulare in un ambiente 2D, ed è quindi indipendente di una varietà di caratteristiche critiche per l'invasione in vivo, ad esempio attività della proteasi ^7. Il test può transwell invasione delle cellule modello migliore quando gli inserti e sono rivestiti con i substrati ECM, ma solo un unico parametro, cioè la comparsa di cellule sulla superficie della membrana opposta è misurata, e molte sfumature di invasione delle cellule non sono così facilmente osservabile. In contrasto con queste tecniche, il saggio delle cellule del cancro invasione sferoide (Figura 1 </ strong>) permette per il monitoraggio in tempo reale di invasione delle cellule in un ambiente che non è solo fisiologicamente rilevanti, ma permette anche importanti caratteristiche specifiche della linea di cellule per essere visualizzati, come la migrazione delle cellule individuale contro collettiva ^8. Questo metodo permette anche vantaggi rispetto ai saggi di crescita della cultura 3D standard. La generazione di aggregati cellulari tramite il metodo goccia appeso limita inizialmente il movimento delle cellule, in modo che le cellule saranno incentivati ​​ad invadere dopo questo vincolo viene sollevato. Inoltre, una volta che vincolo viene sollevato, l'uscita cella procederà in una direzione uniforme, che può quindi essere quantificata convenientemente.

I materiali ECM più popolari utilizzati per cellulari tumorali sferoidi test sono Matrigel e collagene di tipo I, dove ognuna di queste componenti ha ruoli importanti e distinti a influenzare il comportamento metastatico. Matrigel è una miscela di secreto proteine ​​prodotte da cellule di sarcoma Engelbreth-Holm Sciame di topo, e si arricchisce in basemeproteine ​​di membrana nt quali laminina, entactina, e collagene di tipo IV ^9. Per questo motivo Matrigel è seguito definita come "materiali della membrana basale." Questi materiali forniscono membrana basale ligandi essenziali necessari per integrina adesione durante l'invasione delle cellule del cancro ¹⁰ oltre a molte altre proteine ​​che esercitano una gamma di effetti sul comportamento cellulare ^11. In confronto, collagene di tipo I, comunemente preparato da acido digest di tendini e altre strutture collagene dense ^12, è un materiale di matrice molto più semplice che serve come un importante elemento strutturale dei tessuti e stroma sostegno tessuti connettivi ed organi del corpo. È stato dimostrato che le caratteristiche fisiche di collagene possono regolare un numero di caratteristiche di motilità cellulare; per esempio, l'allineamento delle fibrille di collagene all'interfaccia tumore stromale permette alle cellule tumorali di migrare successivamente lungo queste fibrille quando invadere nel stroma ¹³. Nel saggio qui presentato, sia di tipo I collagene e di materie membrana basale sono utilizzate come strumenti per studiare le interazioni cellula-stroma cancro 3D.

L'effetto di inibizione o stimolazione di vie che controllano invasione può essere monitorato dopo le cellule sono stati incorporati nella matrice 3D. Le celle possono essere pretrattati durante la crescita in gocce sospese o al momento del trasferimento alla cultura 3D, a seconda che un trattamento prolungato sarà richiesto per modulare invasione. Per i trattamenti brevi, si raccomanda che il farmaco essere miscelato con la sospensione sferoide dopo la raccolta, così come i mezzi che circonderà le culture 3D, per facilitare un'adeguata esposizione al farmaco alle cellule. Successivamente, le cellule stromali normali o tumore-associati possono essere mescolati con il materiale di matrice per valutare il loro ruolo nel modulare l'invasione delle cellule tumorali, o per determinare come il comportamento paracrino e autocrino cellule influenze segnalazione. Questa idea è stata mostrata in uno studio in cui la coculture di colsul cancro e le cellule endoteliali in appesi gocce portato ad una rete vascolare all'interno sferoidi ^14. Infine, i costituenti ECM possono anche essere modificati, come l'invasione delle cellule tumorali è influenzata da diversi substrati ^15. Il metodo presentato qui di seguito vi offre pertanto un quadro per la valutazione invasione delle cellule di cancro in una varietà di condizioni. In generale, si è riscontrato che non tutte le linee cellulari creeranno sferoidi nelle gocce appesi e linee cellulari epiteliali cercando tipicamente formare sfere regolare.

Protocol

1. Generazione di Spheroids Preparare cella singola sospensione per appendere le culture goccia staccando colture di cellule di cancro aderenti del ~ 70% di confluenza con un PBS lavaggio seguito da esposizione a 0,05% soluzione di tripsina-EDTA. Neutralizzare la soluzione di tripsina con colture cellulari e contare le cellule utilizzando una aliquota della sospensione cellulare. Nota: I mezzi di coltura cellulare specifico dipenderà dalla linea cellulare in fase di test. Seguire ATCC raccomandazion…

Representative Results

Usando il saggio di invasione sferoide (figura 1), un pannello di linee cellulari di tumore è stato testato per la loro capacità di formare sferoidi, così come per la quantità di fuoriuscita di cellule esposte dopo l'impianto in una matrice 3D costituiti da materie membrana basale e collagene di tipo I (Tabella 1). Questi risultati dimostrano che non ogni linea cellulare di tumore creerà sferoidi ben formate, dove le linee cellulari che possiedono una morfologia epiteliale …

Discussion

Questo studio ha valutato le prestazioni di un pannello di linee cellulari di cancro in un saggio di invasione sferoide (Tabella 1). Generalmente, troviamo che la formazione sferoide è migliorata in più linee cellulari epiteliali cercando, dove la presenza di giunzioni cellula-cellula promuove la formazione di un'architettura sferoide-like. Linee cellulari noti che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale, come MDA-MB-231 cellule non formano sferoidi nella cultura goccia appeso molto pro…

Materials

Matrigel Growth Factor Reduced	Corning	CB-40234
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg	Millipore	08-115
DMEM	Life Technologies	11995-065
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875-093
PBS	Life Technologies	10010-023
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
100mm TC-treated Dishes	Corning Incorporated	430167
24-well TC-treated Plates	NEST Biotechnlology	702001
Olympus IX-71 Inverted Microscope
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.