A Cancer Cell Spheroid Ensaio para avaliar a invasão em um ambiente 3D

Summary

This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.

Abstract

The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.

Introduction

Está provado que a motilidade célula cancerosa é preditiva do potencial metastático, uma vez que tal comportamento facilita a invasão através da membrana basal e da entrada no sistema circulatório ^1. Mais investigação sobre a motilidade tem-se centrado na forma como as células se comportam de uma configuração bidimensional (2D), embora se tornando-se amplamente reconhecido que o movimento das células em uma matriz tridimensional (3D) é mais representativo de como estas mesmas células vão realmente ² comportar in vivo. Sistemas de cultura 3D são cada vez mais usados ​​para estudar comportamentos celulares que vão desde a morfologia celular, a cinética de crescimento e de sensibilidade às drogas ^3. O desejo de controlar a invasão de células do cancro no contexto de um meio 3D levou à síntese de técnicas anteriormente estabelecidas, envolvendo a geração de agregados de células de 3D ​​(esferóides) através do método de cultura de gota em suspensão ^4, seguido por incorporação destes esferóides numa extracelular 3D matriz (ECM) composta de colágeno e da membrana basal materiais ^5. Este método visa aperfeiçoar estas técnicas anteriormente estabelecidas, fornecendo uma abordagem simplificada que pode ser facilmente utilizado para comparar invasão sob uma variedade de condições experimentais.

Mais formas tradicionais para avaliar a motilidade celular in vitro são o ensaio da ferida-zero e o ensaio transwell ^6. O primeiro ensaio de motilidade celular descreve uma configuração em 2D, e é, por conseguinte, independente de uma variedade de características críticas para a invasão in vivo, por exemplo, actividade de protease de ^7. O ensaio de invasão de células Transwell pode melhor modelo, quando os insertos de cavidades são revestidas com substratos ECM, mas apenas um único parâmetro, isto é, o aparecimento de células sobre a superfície oposta da membrana é medida, e muitas nuances de invasão de células não são, portanto, facilmente observáveis. Em contraste com estas técnicas, o ensaio de invasão de células de cancro esferóide (figura 1 </ forte>) permite a monitorização em tempo real da invasão celular, num ambiente que não só é fisiologicamente relevante, mas também permite características importantes específica da linha de células a serem visualizadas, tais como migração de células indivíduo vs colectiva ^8. Este método também proporciona vantagens em relação aos ensaios padrão de crescimento de cultura 3D. A geração de agregados celulares através do método de gota em suspensão inicialmente restringe o movimento celular, de modo a que as células serão incentivados a invadir após esta restrição será levantada. Além disso, uma vez que a restrição é levantada, a saída de células irá prosseguir numa direcção uniforme, que pode então ser convenientemente quantificado.

Os materiais de ECM mais populares usados ​​para esferóides ensaios de células de câncer são Matrigel e colágeno tipo I, em que cada um destes componentes tem papéis importantes e distintas em influenciar o comportamento metastático. Matrigel é uma mistura de proteínas segregadas por células de sarcoma produzidos Engelbreth Holm Swarm-rato, e é enriquecido em basemeproteínas da membrana nt, tais como laminina, entactina, e colágeno tipo IV ^9. Por esta razão Matrigel é doravante referido como "materiais de membrana basal." Estes materiais de membrana basal proporcionar ligandos essenciais necessários para adesão integrina durante a invasão de células de cancro ^10, além de muitas outras proteínas que exercem uma variedade de efeitos no comportamento das células ^11. Em comparação, o colagénio do tipo I, geralmente preparado a partir de digestões de ácido dos tendões e outras estruturas de colagénio densas ^12, é um material de matriz muito mais simples que serve como um elemento estrutural do tecido do estroma e tecidos conjuntivos de suporte e órgãos do corpo. Foi demonstrado que as características físicas do colagénio pode regular um número de características de motilidade celular; Por exemplo, o alinhamento de fibras de colagénio na interface tumor-estromal permite que as células cancerosas migram subsequentemente ao longo dessas fibrilas ao invadir o estroma ¹³ em. No ensaio aqui apresentado, tanto o colágeno tipo I e materiais da membrana basal são utilizados como ferramentas para estudar as interações célula de câncer 3D-estroma.

O efeito de inibição ou estimulação de caminhos que controlam invasão pode ser monitorizada após as células terem sido incorporados na matriz 3D. As células podem ser pré-tratados durante o crescimento nas gotas de suspensão ou aquando da transferência para a cultura 3D, dependendo se um tratamento prolongado será necessário para modular a invasão. Para tratamentos mais curtos, recomenda-se que a droga ser misturada com a suspensão esferóide após a recolha, assim como os meios de comunicação que vai rodear as culturas em 3D, para facilitar a exposição adequada da droga para as células. Em seguida, as células normais ou associados a tumores do estroma podem ser misturados com o material de matriz para avaliar o seu papel na modulação da invasão de células tumorais, ou para determinar o comportamento de células influências parácrino e autócrino de sinalização. Esta ideia foi demonstrado em um estudo onde a co-cultura de colsobre câncer e células endoteliais em gotas de suspensão levou a uma rede vascular dentro dos esferóides ^14. Finalmente, os componentes ECM também pode ser alterado, como a invasão da célula cancerosa é afetado por diferentes substratos ^15. O método apresentado abaixo, assim, fornecer um quadro para a avaliação da invasão da célula cancerosa sob uma variedade de condições. De um modo geral verificou-se que nem todas as linhas de células irá criar esferóides nas gotas de suspensão e linhas de células epiteliais de aspecto tipicamente formar esferas regulares.

Protocol

1. Geração de esferóides Prepare a suspensão de células individuais para pendurar culturas gota a separar culturas aderentes de células de cancro de ~ 70% de confluência utilizando uma lavagem com PBS, seguido por exposição a uma solução tripsina-EDTA 0,05%. Neutraliza-se a solução de tripsina com meio de cultura de células e contagem das células, utilizando-se uma alíquota da suspensão de células. Nota: O meio de cultura de células específico dependerá da linha celular a ser tes…

Representative Results

Usando o ensaio de invasão esferóide (figura 1), um painel de linhas celulares de cancro foi testado quanto à sua capacidade para formar esferóides, bem como para a quantidade de egresso de células expostas após o implante numa matriz 3D que consiste em materiais de membrana basal e colagénio tipo I (Tabela 1). Estes resultados demonstram que nem toda linha celular de cancro criará esferóides bem formadas, onde as linhas de células que possuem uma morfologia epitelial in v…

Discussion

Este estudo foi avaliado o desempenho de um painel de linhas celulares de cancro em um ensaio de invasão esferóide (Tabela 1). De um modo geral, descobrimos que a formação do esferóide é aumentada em mais as linhas de células epiteliais de aspecto, em que a presença de junções célula-célula promove a formação de uma arquitectura do tipo esferóide. Linhas celulares conhecidas que foram submetidos a uma transição epitelial-mesenquimal, tais como MDA-MB-231 não formar esferóides na cultu…

Materials

Matrigel Growth Factor Reduced	Corning	CB-40234
Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg	Millipore	08-115
DMEM	Life Technologies	11995-065
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875-093
PBS	Life Technologies	10010-023
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
100mm TC-treated Dishes	Corning Incorporated	430167
24-well TC-treated Plates	NEST Biotechnlology	702001
Olympus IX-71 Inverted Microscope
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.