Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.
अल्फा-synuclein (α-SYN) प्रोटीन बहुतायत से मुख्य रूप से न्यूरॉन्स के भीतर व्यक्त की, और अलग अलग रूपों की संख्या में मौजूद है – मोनोमर्स, tetramers, oligomers और तंतुओं। बीमारी के दौरान, α-syn प्रोटीन अधिक अघुलनशील बना देती हैं कि oligomers और उच्च आणविक भार समुच्चय के रूप में करने के लिए गठनात्मक परिवर्तन आए। असामान्य रूप से एकत्रित α-syn पार्किंसंस रोग (पीडी), Lewy निकायों (DLB) और विभिन्न सिस्टम शोष (एमएसए) के साथ मनोभ्रंश का नयूरोपथोलोगिकल सुविधा है। बायोकेमिकल लक्षण वर्णन और बढ़ती डिटर्जेंट शक्ति और उच्च गति ultracentrifugation के साथ अघुलनशील α-syn का उपयोग कर बफ़र्स के विश्लेषण के रोग प्रगति के साथ जुड़े α-syn विकृति विज्ञान के विकास का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल पोस्टमार्टम मानव मस्तिष्क के ऊतकों से तेजी से अघुलनशील / एकत्रित α-syn के अलगाव का वर्णन है। इस पद्धति सामान्य और असामान्य α की पढ़ाई करने के लिए संशोधनों के साथ अनुकूलित किया जा सकताअलग α-syn म्यूटेशन को शरण देने ट्रांसजेनिक पशु मॉडल में और साथ ही उनके संबंधित विकृतियों से संबंधित प्रोटीन की न्यायपालिका तंतुमय जमा विशेषता है कि अन्य neurodegenerative रोगों में -syn जीव विज्ञान।
कई neurodegenerative रोगों के बीच आम कुंजी रोग सुविधाओं में से एक एक प्रोटीन / रोग विशिष्ट तरीके से एक में होता है कि असामान्य प्रोटीन समुच्चय के गठन की है। इस प्रकार, अल्जाइमर रोग (ई) में न्यूरॉन्स के भीतर विशेषता extraneuronal amyloid बीटा सजीले टुकड़े और एकत्रित hyperphosphorylated ताऊ जमा कर रहे हैं; Lewy निकायों intraneuronal समावेशन जो कर रहे हैं (एलबीएस), में और भी Lewy neurites (LNS) Lewy निकायों (DLBs) 2-4 के साथ पीडी, पीडी पागलपन और मनोभ्रंश में बुलाया dystrophic न्यूरोनल प्रक्रियाओं के भीतर एकत्रित α-syn जमा। असामान्य α-syn जमा भी एमएसए 5 में glial साइटोप्लास्मिक समावेशन की बानगी घावों में देखा जाता है। हंटिंग्टन रोग में, वहाँ विशेषता पाली-क्यू जमा कर रहे हैं, और असामान्य राल डीएनए प्रोटीन-43 और सारकोमा प्रोटीन (FUS) में जुड़े हुए frontotemporal मनोभ्रंश में जमा कर रहे हैं बंधन। महत्वपूर्ण बात है पीडी के लिए, α-syn जीन म्यूटेशन Cau पाया गया हैपीडी 6-11 प्रमुख एसई ऑटोसोमल। इसके अतिरिक्त, α-syn जीन तीन प्रतीया 12 और दोहराव 13 भी इस प्रकार पीडी के pathomechanisms के लिए बढ़ा α-syn अभिव्यक्ति जोड़ने पारिवारिक पीडी का कारण बनता है। विशेष रूप से, छिटपुट और पारिवारिक दोनों पीडी मामलों α-syn विकृति 14 की असामान्य जमा बंदरगाह। पीडी के लिए वर्तमान में उपलब्ध उपचार उपशामक ही कर रहे हैं और रोकने या निष्ठुर रोग प्रगति में देरी पर कोई प्रभाव नहीं है।
α-syn बहुतायत से मानव मस्तिष्क में व्यक्त की और कुल मस्तिष्क प्रोटीन के बारे में 1% बनाता है। यह न्यूरॉन्स के भीतर अधिक विशेष रूप से मौजूद है, लेकिन glial कोशिकाओं के भीतर कम मात्रा में यद्यपि मौजूद कर सकते हैं। एक विवादास्पद बिंदु एक यादृच्छिक मोनोमर 15 के रूप में या एक जोड़ टेट्रामर 16 के रूप में मौजूद कर सकते हैं जो α-syn के देशी संरचना है। बीमारी के दौरान, α-syn यह misfolded पाने के लिए अनुमति देता है कि इसकी रचना में परिवर्तन और इस प्रक्रिया में रोग pathoge का कारण माना जाता हैNesis। Α-syn और रोग के pathophysiological पहलुओं की जांच के कई वर्षों के बावजूद, रोग तंत्र का सही कारण 14 मायावी बने हुए हैं।
Parkinsonian दिमाग का पोस्टमार्टम विश्लेषण का उपयोग अध्ययन इस प्रकार अब तक α-syn छिटपुट पीडी में और भी दोनों LRRK2 जीन 17-22 में परिवर्तन के साथ जुड़े पीडी के सामान्य और असामान्य जीव विज्ञान के बारे में महत्वपूर्ण सुराग प्रदान की है। इधर, डिग्री बदलती करने के α-syn समुच्चय बंदरगाह कि मानव पोस्टमार्टम पीडी मस्तिष्क के ऊतकों से तेजी से अघुलनशील α-syn जमा करने के लिए एक जैव रासायनिक निष्कर्षण प्रोटोकॉल (देखें योजना चित्रा 1 में प्रस्तुत) वर्णित किया गया है। इस तकनीक को भी अन्य neurodegenerative रोगों 23,24 से कुल प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए बफर रचनाओं में संशोधनों के साथ और भी ट्रांसजेनिक पशु मस्तिष्क के ऊतकों 25-27 से अनुकूलित किया जा सकता है। रूपांतरों के लिए मुख्य विचार solubi में मतभेद रहे हैंlity और जिनमें से कुछ संबंधित प्रोटीन की कुल मात्रा में मुख्य रूप से परमाणु होते हैं और FUS 28 के लिए दिखाया गया है इष्टतम निकासी के लिए उच्च नमक बफ़र्स पड़ सकता है।
यह लेख denaturing जेल चल रहा शर्तों का उपयोग रोगग्रस्त दिमाग से निकासी और मोनोमेरिक, oligomeric का अंतर है घुलनशीलता संपत्तियों की परीक्षा और एकत्रित α-syn के लिए एक जैव रासायनिक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है एकत्रित α-syn 17, 18, 20, 21 अपने मूल रूप में सामान्य रूप से घुलनशील है लेकिन रोग प्रगति के साथ या आनुवंशिक परिवर्तन के साथ amyloidogenic या बढ़ा एकत्रीकरण गुण हासिल है कि एक प्रोटीन। बहरहाल, कुछ समूहों (8% या 10% के बजाय 5%) 21,22, 30। एसडीएस α-syn की झिल्ली बाध्य रूपों में शामिल कर सकते हैं कि oligomers एक anionic डिटर्जेंट और solubilises है उनकी buffers में एसडीएस सांद्रता में मामूली बदलाव का इस्तेमाल किया है α-syn, यूरिया, जबकि एक chaotropic अभिकर्मक α-syn 20 की अघुलनशील एकत्रित और fibrillar या amyloidogenic रूपों denatures। इस संबंध में Paleologou एट अल 31 से एक व्यवस्थित अध्ययन स्थिरता की जांच कीα-syn oligomers और यूरिया की अलग सांद्रता के साथ तंतुओं के (6.5-8 मीटर) या एसडीएस (0.25-2%) और सूचना दी कि यूरिया की उच्च सांद्रता के साथ एसडीएस सांद्रता में स्थिर नहीं बल्कि oligomers। Α-syn oligomers और तंतुओं के लिए विशिष्ट उनकी फिला -1 एंटीबॉडी, गैर denaturing शर्तों के तहत 6.5 एम यूरिया सांद्रता में तंतुओं के उच्च सांद्रता का पता चला। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल बफर सांद्रता बारीकी Culvenor एट अल में वर्णित किया गया है दर्पण। (1999) 32।
अघुलनशील α-syn के जैव रासायनिक निकासी के लिए संरचनात्मक मस्तिष्क क्षेत्रों का चयन सावधानी से किया जाना चाहिए और इस रोग प्रगति 33,34 के आधार पर α-syn पौंड और एलएन लोड प्रतिबिंबित करना चाहिए। यहां इस्तेमाल मामलों McKeith के अनुसार पीडी प्रगति की देर और मध्यवर्ती चरणों को दर्शाती पीडी के neocortical और लिम्बिक उपप्रकार से बेसल गैन्ग्लिया के नमूने 34 ctriteria हैं। रानी स्क्वायर ब्रेन बैंक में, मस्तिष्क के एक आधा हैनियमित रूप से histochemical विश्लेषण के लिए formalin में तय की और दूसरे आधे ध्यान से विभिन्न संरचनात्मक क्षेत्रों में विच्छेदित है और फ्लैश जमे हुए हैं और जैव रासायनिक आगे और डीएनए / आरएनए विश्लेषण अध्ययन के लिए -80 ओ सी फ्रीजर में संग्रहीत। Neuropathologists से दिमाग और विच्छेदन की formalin निर्धारण के बाद, इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री संग्रहीत α-syn एंटीबॉडी और परिणामों का उपयोग किया जाता है। इसके अलावा एक नियमित प्रक्रिया के रूप में, मस्तिष्क के ऊतकों का पीएच मस्तिष्क के ऊतकों के अंतकाल राज्य के एक उपाय के रूप में आगमन पर मापा जाता है। यह जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए ऊतक संरक्षण की गुणवत्ता के लिए एक फर्म आधार बनाता है।
हमारे यहाँ डेटा अधिक एसडीएस नियंत्रण की तुलना में पीडी मामलों में घुलनशील α-syn मोनोमर देखते हैं कि पता चलता है; विशेष रूप से neocortical पीडी मामलों लिम्बिक पीडी किस्म की तुलना में अधिक है α-syn भार है। neocortical मामलों में इस तरह के ललाट और पार्श्विका भ्रष्टाचार के रूप में neocortical क्षेत्रों में पीडी α-syn विकृति का अधिक से अधिक प्रगति का प्रतिनिधित्व33,34 tices। लिम्बिक पीडी मामलों में इस तरह के प्रमस्तिष्कखंड, transentorhinal और सिंगुलेट क्षेत्रों के रूप में बेसल अग्रमस्तिष्क / लिम्बिक क्षेत्रों क्षेत्रों में उच्च पौंड स्कोर है। सार्थक डेटा और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, एक-एक पलटन से कम से कम 4 मामलों चलाना चाहिए। इसी तरह हम यहाँ प्रस्तुत धब्बा डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण करने का प्रयास नहीं किया है।
यह भी अलग अलग एंटीबॉडी विभिन्न रूपों / उच्च आदेश α-syn oligomers की संरचना को पहचान सकते हैं और प्रत्येक का अपना रिश्तेदार संवेदनशीलता और वरीयता हो सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। वे 4 अलग α-syn एंटीबॉडी (सिन-1, एस एस, Onco और LB509) α-syn oligomers / समुच्चय के लिए कम से कम अस्थिर परिणाम दे पता चलता है कि जहां यह टोंग एट अल। 29 के परिणामों से स्पष्ट है। इन α-syn एंटीबॉडी मिलान या तो एन टर्मिनल या सी में स्थित है, इस पर निर्भर बदलाव हो सकता है, हालांकि α-syn मोनोमर्स सभी 4 एंटीबॉडी द्वारा इसी तरह के विस्तार के लिए मान्यता प्राप्त किया गया29 -terminal। प्रजातियों 20,21 synuclein α-इसी तरह, phospho-अल्फा के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी synuclein अलग उच्च आणविक भार निर्धारित करते हैं। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, अत्यधिक विशेषता एंटीबॉडी सिन-1 19-21 इस्तेमाल किया गया है।
हालांकि, यह कोशिकाओं में भी प्रोटीन की overexpression और पछाड़ना एंटीबॉडी preabsorption प्रयोगों के माध्यम से पश्चिमी blots पर किसी भी नई एंटीबॉडी मान्य और विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है।
यह α-syn और या अस्थिर tetrameric α-syn रूपों के छोटे टुकड़े को निर्धारित करने के शोधकर्ताओं द्वारा लागू किया गया है कि अन्य रूपों पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस tetramers 36 को स्थिर करने के लिए α-syn 35 या पार linkers के साथ नमूना homogenates के इलाज का छोटा रूपों बनाए रखने के लिए पीबीएस में 0.4% पीएफए के साथ झिल्ली के हल्के-निर्धारण शामिल हो सकते हैं।
पोस्टमार्टम तिवारी का उपयोग कर प्रोटीन की सटीक जैव रासायनिक मूल्यांकनssue एंजाइमी प्रोटीन गिरावट और संशोधन के न्यूनतम आवश्यकता है। यह मामला साथियों के भीतर से मिलान नमूने कम से कम पोस्टमार्टम में देरी के साथ ऊतक का उपयोग करें और / या चयन करने के लिए इसलिए उचित है। Α-syn immunohistochemistry के लिए मानक एंटीबॉडी का उपयोग Immunohistochemistry अलगाव प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए। α-syn विकृति की हद तक अत्यधिक परिवर्तनशील है और चयनित क्षेत्रों के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। यह हर रन के साथ इष्टतम उपज के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रचुर मात्रा में विकृति के साथ क्षेत्रों का चयन करने की सलाह दी जाती है। आवश्यक फॉस्फेट अवरोधकों प्रोटीज अवरोधकों की और यदि उपयोग सेल के दौरान होने वाली और 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को बनाए रखने इंट्रासेल्युलर प्रोटिएजों या फास्फेटेजों की रिहाई के बाद महत्वपूर्ण है अवांछित enzymatic गिरावट को रोकने के लिए।
यह प्रयोगों के बैच के भीतर नमूने के सभी इंट्रा-उपयोगकर्ता विविधताओं से बचने के लिए समान रूप से और लगातार नियंत्रित किया जाता है कि महत्वपूर्ण है; कई freइस संभावित ऐसे फास्फोरिलीकरण के रूप में बाद translational संशोधनों को वापस लेना हो सकता है के रूप में EZE पिघलना चक्र से बचा जाना चाहिए। नमूनों की एक बड़ी संख्या का परीक्षण immunoblots से डेटा जैल पर अन्य सभी के नमूने, और कहा कि नमूने के लिए संदर्भित सभी डेटा के समानांतर में चलाने चाहिए जो एक नमूना है, के लिए सामान्यीकृत होना चाहिए कि जब एक महत्वपूर्ण बिंदु को ध्यान में रखना। यह कई दाग के बीच immunoblot डेटा को सामान्य बनाने को सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है। यह हमारे हाल के एक अध्ययन में 22 में अपनाया विधि है।
यह कम पृष्ठभूमि ईसीएल रखने के लिए, दाग पश्चिमी धब्बा प्रोटोकॉल के दौरान किसी भी समय पर बाहर सुखाने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इस ईसीएल संकेत के संतृप्ति को बढ़ावा मिलेगा और गलत quantitation के लिए नेतृत्व करेंगे के रूप में इसके अलावा, autoradiography फिल्मों पर बहुत लंबे निवेश (> 10 मिनट) से बचा जाना चाहिए।
यह ऊपर प्रोटोकॉल आम प्रयोगशाला अभिकर्मकों और में उपयोग कर एक अपेक्षाकृत सरल तकनीक हैstruments और पीडी अनुसंधान में α-syn प्रोटीन के pathophysiology की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है। यह पद्धति केवल α-syn ट्रांसजेनिक जानवरों में α-syn जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उचित संशोधनों के साथ भी है लेकिन इस तरह के विज्ञापन, एमएसए, DLB, HD और frontotemporaldementias के रूप में एकत्रित प्रोटीन की असामान्य जमा की विशेषता अन्य neurodegenerative रोगों के लिए बढ़ाया जा सकता है। हालांकि यहां वर्णित पश्चिमी धब्बा डेटा भी α-syn 31 के विशिष्ट रूपों के लिए एंटीबॉडी का उपयोग एंजाइम से जुड़ी immunosorbent assays का उपयोग मान्य किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
I thank Dr Adamantios Mamais for extracting α-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson’s Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.
Tris-HCL | Sigma | T5912 | |
sodium chloride | VWR | 27800.291 | |
SDS | Fluka | 71727 | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Protease inhibitor tablets | Roche | 04 693 116001 | |
Phosphatase inhibitor tablets | Roche | 04 906 837001 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | P4417 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
NuPAGE MOPS SDS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
NuPAGE transfer buffer | Invitrogen | NP0006-1 | |
Hybond-P membrane | GE Healthcare | RPN303F | |
Whatman 3MM filter paper | Sigma | WHA30306185 | |
Bis-tris gels 4-12% | Invitrogen | NP0322BOX | |
Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
Bio-RAD DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | |
Thickwall Beckman Polycarbonate tubes | Beckman | 355630 | |
Western blot stripping buffer | Thermo scientific | 46430 | |
Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 610786 | |
beta-actin primary antibody (mouse monoclonal | Sigma | A5441 | |
HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody | Santa Cruz | sc-2031 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
Instrument | Company | Rotor/ model no | |
Benchtop Ultracentrifuge Optima Max | Beckman | MLA-80 | |
Sonicator | Heat Systems | XL20-20 | |
Homogeniser | Jenke and Kunkel | TP18/10 |