Approches expérimentales pour l'étude mitochondrial Localisation et fonction d'une cellule du cycle nucléaire Kinase, Cdk1
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
Chez les mammifères, la progression du cycle cellulaire dépend d'événements hautement ordonnés contrôlés par des cyclines et des kinases cycline-dépendantes (CDK) 1. Grâce à son cytoplasmique, nucléaire, et la localisation centrosomale, CyclinB1 / Cdk1 est capable de synchroniser différents événements dans la mitose, comme l' éclatement de l' enveloppe nucléaire et la séparation centrosome 2. CyclinB1 / Cdk1 protège les cellules contre l' apoptose mitose 3 et favorise la fission mitochondriale, une étape critique pour une répartition égale des mitochondries des cellules filles nouvellement formées 4.
Dans la prolifération des cellules de mammifères, mitochondriale d'ATP est généré par la phosphorylation oxydative (OXPHOS) la machine (chaîne de transport d'électrons), qui est composée de 5 complexes de sous-unités multiples; Complexe I – V complexe (CI-CV). Nicotinamide adénine dinucléotide (NADH): ubiquinone oxydoréductase ou complexe I (CI) est le plus grand et le moins bien compris des cinq complexes 5. Le c complexeonsists de 45 sous-unités, dont 14 forment le noyau catalytique. Une fois assemblé, le complexe prend une structure en forme de L avec une branche qui pénètre dans la matrice et l'autre bras noyé dans la membrane interne de 6,7. Les mutations dans les sous – unités de CI sont à l'origine d'une variété de troubles mitochondriaux 8. Un CI fonctionnellement efficace OXPHOS est nécessaire non seulement pour la respiration mitochondriale globale 9, mais aussi pour la cellule réussie progression du cycle 10. Démêler les mécanismes sous-jacents au fonctionnement de ce complexe enzymatique liée à la membrane dans la santé et la maladie pourrait permettre le développement de nouvelles procédures de diagnostic et des stratégies thérapeutiques de pointe. Dans une étude récente, nous avons constaté que le / complexe Cdk1 de CyclinB1 translocation dans les mitochondries dans le G2 / (mitose) phase (Gap 2) M et phosphoryle sous-unités CI pour améliorer la production d'énergie mitochondriale, ce qui pourrait compenser les besoins énergétiques accrus de cellules pendant la cellule cycle de 11. Ici, nous SHOwcase procédures expérimentales et les stratégies qui peuvent être utilisés pour étudier la translocation mitochondriale des kinases autrement nucléaires / cytoplasmiques, leurs substrats mitochondriaux ainsi que les conséquences fonctionnelles de leur localisation mitochondriale utilisant CyclinB1 / Cdk1 comme un exemple.
La constatation que le / complexe Cdk1 de CyclinB1 translocation dans les mitochondries en cas de besoin incité les études de surexpression et knockdown de ce complexe spécifique de mitochondries. Pour parvenir à une expression spécifique des mitochondries de protéines, on peut ajouter une séquence de ciblage mitochondrial (MTS) à l'extrémité N-terminale de la protéine d'intérêt. Mitochondrie séquences de ciblage permettent le tri des protéines mitochondriales dans les mitochondries où ils résident normalement 12. Nous avons utilisé une séquence de ciblage 87 mitochondries de base dérivé du précurseur du cytochrome humain sous-unité c oxydase 8A (COX8) et cloné dans Green Fluorescent Protein (GFP) -tagged CyclinB1 ou rouge fluorescentProtein (RFP) -tagged Cdk1 contenant des plasmides dans le cadre. Cette méthode nous a permis de cibler CyclinB1 et Cdk1 dans les mitochondries, en changeant spécifiquement l'expression mitochondrial de ces protéines sans affecter leur piscine nucléaire. Par marquage par fluorescence ces protéines, nous avons été en mesure de suivre leur localisation en temps réel. De même, nous avons introduit MTS dans un plasmide contenant DP-tagged dominante Cdk1 négative, ce qui nous a permis de frapper spécifiquement vers le bas l'expression mitochondrial et les fonctions de Cdk1. Il est essentiel de faire la distinction entre les fonctions mitochondriales et nucléaires des kinases qui ont deux localisations comme Cdk1. Ingénierie MTS dans la N-terminale de ces kinases fonctionnelles double offre une grande stratégie qui est facile à employer et efficace.
Etant donné que Cdk1 est une kinase du cycle cellulaire, il est essentiel de déterminer la progression du cycle cellulaire lorsque Cdk1 est localisé dans les mitochondries. Pour ce faire, nous avons utilisé une nouvelle méthod pour surveiller la teneur en ADN dans les cellules. Les méthodes traditionnelles comprennent l'utilisation de la BrdU (bromodésoxyuridine), un analogue de la thymidine synthétique, qui incorpore dans l'ADN nouvellement synthétisé au cours de la phase S du cycle cellulaire pour remplacer thymidine. Ensuite, les cellules qui se répliquent activement leur ADN peuvent être détectés en utilisant des anticorps anti-BrdU. Un inconvénient de cette méthode est qu'elle nécessite la dénaturation de l' ADN pour fournir un accès pour l'anticorps BrdU par des méthodes chimiques comme le traitement de l' acide ou de la chaleur, ce qui peut entraîner une incompatibilité entre les résultats 13,14. Sinon, nous avons utilisé une approche similaire pour surveiller les cellules qui se divisent activement avec un analogue de la thymidine différente, EdU. la détection EdU ne nécessite pas sévère dénaturation de l'ADN en tant que traitement de détergent permet au réactif de détection pour accéder à la EdU dans l'ADN nouvellement synthétisé. La méthode EdU a prouvé être plus fiable, cohérente et avec un potentiel d'analyse à haut débit 15.
Enfin, le to déterminer les substrats mitochondriaux de Cdk1, nous avons utilisé un outil de protéomique appelé 2D-DIGE, qui est une version avancée de l'électrophorèse sur gel à deux dimensions classique. électrophorèse bidimensionnelle sépare les protéines en fonction de leur point isoélectrique dans la première dimension et un poids moléculaire dans le second. Etant donné que des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation affectent le point isoélectrique et le poids moléculaire des protéines, des gels 2D peuvent détecter les différences entre les états de phosphorylation de protéines dans les différents échantillons. La taille (surface et intensité) de la protéine voit des changements au niveau des protéines d'expression, ce qui permet une comparaison quantitative entre plusieurs échantillons. En utilisant cette méthode, nous avons été en mesure de différencier les protéines phosphorylées en type sauvage par rapport aux cellules mutantes mitochondries ciblées Cdk1 exprimant. Les taches de protéines spécifiques qui ont montré dans le type sauvage, mais il manquait dans le mutant Cdk1 préparation des mitochondries ciblées ont été isolées etidentifié par spectrométrie de masse.
Dans les gels 2D traditionnels, les colorants triphénylméthane sont utilisés pour visualiser les protéines sur le gel. 2D-DIGE utilise des étiquettes de protéines fluorescentes avec un effet minimal sur la protéine mobilité électrophorétique. Des échantillons de protéines différentes peuvent être marqués avec différents colorants fluorescents, mélangés entre eux et séparés par des gels identiques, ce qui permet le co-électrophorèse des échantillons multiples sur un seul gel 16. Cela permet de minimiser les variations de gel de gel, ce qui est un problème critique dans les études protéomiques à base de gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme les protéines destinées à d' autres organites sous – cellulaires, les protéines mitochondriales cible possèdent des signaux de ciblage au sein de leur structure primaire ou secondaire qui les dirigent vers l'organite avec l'assistance de translocation de protéines complexes et plieuses 21,22. Mitochondrie séquences de ciblage (MTS) obtenues à partir des protéines résidentes exclusivement mitochondriales telles que COX8 peuvent être ajoutés à extrémité N-terminale d'une sé…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
References
- Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
- Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
- Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
- Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
- Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
- Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
- Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
- Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
- Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
- Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
- Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
- Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
- Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3′-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
- Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic ‘click’ reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
- Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
- Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25 (2009).
- Davies, D., Macey, M. G. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. , 257-276 (2007).
- van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
- Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
- Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
- Karniely, S., Pines, O. Single translation–dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
- Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
- Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341 (2010).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
- Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
- Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).
