प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का अध्ययन करने के लिए Mitochondrial स्थानीयकरण और एक परमाणु कोशिका चक्र kinase, Cdk1 के फंक्शन
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
स्तनधारियों में, कोशिका चक्र प्रगति cyclins और cyclin निर्भर kinases (Cdks) 1 द्वारा नियंत्रित उच्च आदेश दिया की घटनाओं पर निर्भर है। इसकी cytoplasmic, परमाणु, और centrosomal स्थानीयकरण के माध्यम से, CyclinB1 / Cdk1 इस तरह के परमाणु लिफाफा टूटने और केंद्रपिंड जुदाई 2 के रूप में बँटवारा में अलग अलग घटनाओं सिंक्रनाइज़ करने में सक्षम है। CyclinB1 / Cdk1 apoptosis 3 के खिलाफ mitotic कोशिकाओं की रक्षा करता है और mitochondrial विखंडन, नवगठित बेटी कोशिकाओं से 4 माइटोकॉन्ड्रिया की एक समान वितरण के लिए एक महत्वपूर्ण कदम को बढ़ावा देता है।
स्तनधारी कोशिकाओं proliferating में, mitochondrial एटीपी आक्सीकारक फास्फारिलीकरण (OXPHOS) मशीनरी (इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला) है, जो 5 बहु सबयूनिट परिसरों से बना है के माध्यम से उत्पन्न होता है; जटिल मैं – जटिल वी (सीआई-सीवी)। निकोटिनामाइड अडीनाइन डाईन्यूक्लियोटाइड (NADH): ubiquinone oxidoreductase या जटिल मैं (सीआई) के सबसे बड़े और कम से कम पांच परिसरों 5 की समझ में आ रहा है। जटिल ग45 सब यूनिटों, जिनमें से 14 की onsists उत्प्रेरक मूल रूप में। एक बार इकट्ठे, जटिल एक हाथ मैट्रिक्स और दूसरे हाथ भीतरी झिल्ली 6.7 में एम्बेडेड में फैला हुआ है के साथ एक एल के आकार का संरचना मान लिया गया है। सीआई सब यूनिटों में म्यूटेशन mitochondrial विकारों 8 की एक किस्म के कारण हैं। OXPHOS में एक कार्यात्मक कुशल सीआई न केवल समग्र mitochondrial श्वसन 9 के लिए, लेकिन यह भी सफल सेल चक्र प्रगति 10 के लिए आवश्यक है। तंत्र इस झिल्ली ही सीमित स्वास्थ्य और रोग में एंजाइम जटिल के कामकाज अंतर्निहित Unravelling उपन्यास नैदानिक प्रक्रियाओं और उन्नत चिकित्सकीय रणनीति के विकास को सक्षम हो सकता है। हाल ही में एक अध्ययन में हमने पाया है कि CyclinB1 / Cdk1 परिसर (गैप) 2 जी 2 / (धोखा) एम चरण में माइटोकॉन्ड्रिया में translocates और सीआई सब यूनिटों phosphorylates mitochondrial ऊर्जा उत्पादन, संभावित बढ़ाने के लिए सेल के दौरान कोशिकाओं की वृद्धि की ऊर्जा जरूरतों को ऑफसेट करने के लिए 11 चक्र। यहाँ हम थानेदारप्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और रणनीति है कि अन्यथा परमाणु / cytoplasmic kinases की mitochondrial translocation अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, उनके mitochondrial substrates के रूप में अच्छी तरह से उनके mitochondrial स्थानीयकरण CyclinB1 / Cdk1 एक उदाहरण के रूप में प्रयोग के कार्यात्मक परिणामों wcase।
लग रहा है कि CyclinB1 / Cdk1 जटिल जब जरूरत माइटोकॉन्ड्रिया विशेष overexpression और इस परिसर के पछाड़ना के अध्ययन के लिए प्रेरित किया माइटोकॉन्ड्रिया में translocates। प्रोटीन के माइटोकॉन्ड्रिया विशिष्ट अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए, एक ब्याज की प्रोटीन के एन टर्मिनस में माइटोकॉन्ड्रिया को निशाना अनुक्रम (एमटीएस) जोड़ सकते हैं। लक्षित कर दृश्यों माइटोकॉन्ड्रिया माइटोकॉन्ड्रिया जहां वे सामान्य रूप से रहते हैं 12 में mitochondrial प्रोटीन की छँटाई अनुमति देते हैं। हम एक 87 आधार माइटोकॉन्ड्रिया को निशाना मानव साइटोक्रोम ग oxidase सबयूनिट 8A (COX8) के अग्रदूत से निकाली गई अनुक्रम का इस्तेमाल किया और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) में यह क्लोन है CyclinB1 या लाल फ्लोरोसेंट -taggedप्रोटीन (आरएफपी) -tagged Cdk1 फ्रेम में plasmids हैं। इस विधि हमें माइटोकॉन्ड्रिया में CyclinB1 और Cdk1 निशाना बनाने की अनुमति दी है, विशेष रूप से उनके परमाणु पूल को प्रभावित किए बिना इन प्रोटीनों की mitochondrial अभिव्यक्ति बदल रहा है। fluorescently इन प्रोटीनों टैग करके, हम वास्तविक समय में अपने स्थानीयकरण निगरानी करने में सक्षम थे। इसी तरह, हम जो हमें विशेष रूप से mitochondrial अभिव्यक्ति और Cdk1 के कार्यों नीचे दस्तक करने की अनुमति एक प्लाज्मिड आरएफपी टैग प्रमुख नकारात्मक Cdk1 युक्त, एमटीएस में पेश किया है। यह kinases Cdk1 तरह दोहरी localizations है कि mitochondrial और परमाणु कार्यों के बीच अंतर करने के लिए आवश्यक है। इन दोहरी कार्यात्मक kinases के एन टर्मिनल में इंजीनियरिंग एमटीएस एक महान रणनीति नियोजित किया जा करने के लिए आसान और प्रभावी है कि प्रदान करता है।
चूंकि Cdk1 एक कोशिका चक्र काइनेज है, यह कोशिका चक्र प्रगति का निर्धारण करने के लिए जब Cdk1 माइटोकॉन्ड्रिया में स्थानीय है मौलिक है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, हम एक नई metho का उपयोग किया हैडी कोशिकाओं में डीएनए सामग्री की निगरानी करने के लिए। पारंपरिक तरीकों thymidine स्थानापन्न करने के लिए BrdU (bromodeoxyuridine), एक सिंथेटिक thymidine एनालॉग, जो कोशिका चक्र के एस चरण के दौरान नए संश्लेषित डीएनए में शामिल किया गया है का उपयोग शामिल है। तब कोशिकाओं है कि सक्रिय रूप से उनके डीएनए को दोहरा रहे हैं विरोधी BrdU एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है। इस पद्धति का एक नुकसान यह है कि यह डीएनए के विकृतीकरण की आवश्यकता है एसिड या गर्मी उपचार की तरह कठोर तरीके हैं, जो परिणामों 13,14 के बीच विसंगति में हो सकता है द्वारा BrdU एंटीबॉडी के लिए पहुँच प्रदान करना है। वैकल्पिक रूप से, हम एक समान दृष्टिकोण एक अलग thymidine अनुरूप, edu के साथ सक्रिय रूप से विभाजित कोशिकाओं की निगरानी के लिए उपयोग किया। Edu का पता लगाने के लिए कठोर डीएनए विकृतीकरण की आवश्यकता नहीं है के रूप में हल्के साबुन उपचार नए संश्लेषित डीएनए में edu उपयोग करने के लिए पता लगाने अभिकर्मक सक्षम बनाता है। Edu विधि, और अधिक विश्वसनीय सुसंगत और उच्च throughput विश्लेषण 15 के लिए क्षमता के साथ साबित हो गया है।
अंत में, टीओ निर्धारित Cdk1 की mitochondrial substrates, हम शास्त्रीय दो आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन का एक उन्नत संस्करण है जो 2 डी DIGE नामक एक प्रोटिओमिक्स उपकरण का इस्तेमाल किया। दो आयामी वैद्युतकणसंचलन प्रथम आयाम और दूसरे में आणविक वजन में उनकी समविद्युतविभव बिंदु के अनुसार प्रोटीन को अलग करती है। चूंकि इस तरह के रूप में फोस्फोराइलेशन बाद translational संशोधनों समविद्युतविभव बिंदु और प्रोटीन की आणविक वजन को प्रभावित, 2 डी जैल विभिन्न नमूनों के भीतर प्रोटीन की phosphorylation स्थितियों के बीच अंतर का पता लगा सकते हैं। प्रोटीन का आकार (क्षेत्र और तीव्रता) प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर के साथ परिवर्तन स्पॉट, कई नमूनों के बीच मात्रात्मक तुलना की इजाजत दी। इस विधि का प्रयोग, हम बनाम उत्परिवर्ती माइटोकांड्रिया-लक्षित Cdk1 व्यक्त कोशिकाओं जंगली प्रकार में फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन को अलग करने में सक्षम थे। विशिष्ट प्रोटीन स्पॉट है कि जंगली प्रकार में दिखाया लेकिन माइटोकांड्रिया-लक्षित उत्परिवर्ती Cdk1 तैयारी में याद कर रहे थे और अलग थेमास स्पेक्ट्रोमेट्री के माध्यम से पहचान की।
पारंपरिक 2 डी जैल में, triphenylmethane रंगों जेल पर प्रोटीन कल्पना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। 2 डी DIGE प्रोटीन electrophoretic गतिशीलता पर कम से कम प्रभाव के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबल के उपयोग करता है। विभिन्न प्रोटीन के नमूने विभिन्न फ्लोरोसेंट रंजक, एक साथ मिश्रित और समान जैल से अलग कर दिया, एक भी जेल 16 पर कई नमूने के सह वैद्युतकणसंचलन अनुमति के साथ लेबल किया जा सकता है। इस जेल के लिए जेल विविधताओं, जो जेल आधारित प्रोटिओमिक्स अध्ययन में एक महत्वपूर्ण समस्या है कम करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटीन अन्य subcellular अंगों के लिए किस्मत की तरह, mitochondrial लक्षित प्रोटीन उनके प्राथमिक या माध्यमिक संरचना के भीतर लक्षित करने का संकेत है कि उन्हें विस्तृत प्रोटीन translocating और तह मशीनों की सहायता से 21,22 organelle क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
References
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