Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
Nei mammiferi, la progressione del ciclo cellulare dipende da eventi altamente ordinate controllati da cicline e chinasi ciclina-dipendenti (CDK) 1. Attraverso la sua citoplasmatica, nucleare, e la localizzazione centrosomica, CyclinB1 / Cdk1 è in grado di sincronizzare i diversi eventi in mitosi, come ripartizione membrana nucleare e la separazione centrosome 2. CyclinB1 / Cdk1 protegge le cellule in mitosi contro l'apoptosi 3 e promuove fissione mitocondriale, un passaggio fondamentale per un'equa distribuzione dei mitocondri delle cellule figlie di nuova formazione 4.
In proliferazione cellule di mammifero, mitocondriale ATP viene generato tramite fosforilazione ossidativa (OXPHOS) macchinari (catena di trasporto degli elettroni), che si compone di 5 complessi multi-subunità; complesso I – V complesso (CI-CV). Nicotinamide adenina dinucleotide (NADH): ubichinone ossidoriduttasi o complesso I (CI) è il più grande e meno compreso dei cinque complessi 5. Il complesso consists di 45 subunità, di cui 14 costituiscono il nucleo catalitico. Una volta assemblato, il complesso assume una struttura a forma di L con un braccio che sporge nella matrice e l'altro braccio incorporato nella membrana interna 6,7. Le mutazioni in subunità CI sono la causa di una varietà di disturbi mitocondriali 8. Un CI funzionalmente efficiente in OXPHOS è necessaria non solo per la respirazione mitocondriale nel complesso 9, ma anche per la progressione del ciclo cellulare di successo 10. Svelare i meccanismi alla base del funzionamento di questo complesso enzimatico di membrana in salute e malattia potrebbe consentire lo sviluppo di nuove procedure diagnostiche e strategie terapeutiche avanzate. In un recente studio, abbiamo trovato che il / nel complesso Cdk1 CyclinB1 trasloca nei mitocondri nel (Gap 2) G2 / (mitosi) fase M e fosforila subunità CI per aumentare la produzione di energia mitocondriale, potenzialmente per compensare l'aumento del fabbisogno energetico delle cellule durante cella ciclo 11. Qui abbiamo showcase procedure sperimentali e strategie che possono essere utilizzati per studiare traslocazione mitocondriale di chinasi altrimenti nucleari / citoplasmatici, loro substrati mitocondriali nonché conseguenze funzionali della loro localizzazione mitocondriale utilizzando CyclinB1 / Cdk1 come esempio.
La constatazione che il / nel complesso Cdk1 CyclinB1 trasloca nei mitocondri quando necessario richiesto studi di sovraespressione specifici mitocondri e atterramento di questo complesso. Per raggiungere-specifico espressione mitocondri delle proteine, si può aggiungere un mitocondri di targeting sequenza (MTS) in N-terminale della proteina di interesse. I mitocondri di targeting sequenze consentono lo smistamento delle proteine mitocondriali nei mitocondri dove normalmente risiedono 12. Abbiamo usato una sequenza di mira 87 mitocondri di base derivato dal precursore di citocromo c ossidasi subunità umana 8A (COX8) e clonati in Green Fluorescent Protein (GFP) -tagged CyclinB1 o rosso fluorescenteProteine (RFP) -tagged Cdk1 contenenti plasmidi nel telaio. Questo metodo ci ha permesso di indirizzare CyclinB1 e Cdk1 nei mitocondri, in particolare modificando l'espressione di queste proteine mitocondriali senza compromettere la loro piscina nucleare. Con codifica fluorescenti queste proteine, siamo stati in grado di monitorare la loro localizzazione in tempo reale. Allo stesso modo, abbiamo introdotto MTS in un plasmide contenente RFP-tag dominante negativo Cdk1, che ci ha permesso di battere specificamente verso il basso l'espressione mitocondriale e le funzioni di Cdk1. È essenziale distinguere tra le funzioni mitocondriali e nucleari delle chinasi che hanno localizzazioni doppi come Cdk1. Ingegneria MTS nel N-terminale di queste chinasi funzionali duali offre una grande strategia che è facile da impiegare ed efficace.
Poiché Cdk1 è una chinasi del ciclo cellulare, è fondamentale per determinare la progressione del ciclo cellulare quando Cdk1 è localizzato nei mitocondri. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo utilizzato un nuovo method per monitorare il contenuto di DNA nelle cellule. I metodi tradizionali includono utilizzando BrdU (bromodeoxyuridine), un analogo sintetico della timidina, che incorpora nel DNA di nuova sintesi nella fase S del ciclo cellulare per sostituire timidina. Quindi le cellule che sono attivamente replicano il loro DNA possono essere rilevati utilizzando anticorpi anti-BrdU. Uno svantaggio di questo metodo è che richiede denaturazione del DNA per fornire l'accesso per l'anticorpo BrdU mediante metodi dure come trattamento acido o di calore, che può provocare incoerenza tra i risultati 13,14. In alternativa, abbiamo utilizzato un approccio simile per monitorare le cellule in divisione attiva con un diverso analogico timidina, edu. rilevamento EdU non richiede aspra denaturazione del DNA come trattamento detergente neutro consente il reagente di rilevamento per accedere al EdU nel DNA di nuova sintesi. Il metodo EdU ha dimostrato di essere più affidabile, coerente e con un potenziale di analisi ad alta produttività 15.
Infine, to determinare i substrati mitocondriali di Cdk1, abbiamo utilizzato uno strumento chiamato proteomica 2D-DIGE, che è una versione avanzata del classico gel elettroforesi bidimensionale. Elettroforesi bidimensionale separa le proteine in base al loro punto isoelettrico nella prima dimensione e peso molecolare nel secondo. Poiché modificazioni post-traduzionali come fosforilazione influenzano il punto isoelettrico e peso molecolare delle proteine, gel 2D possono rilevare le differenze tra stati di fosforilazione di proteine all'interno diversi campioni. Le dimensioni (area e intensità) di proteine ha visto cambiamenti con il livello di espressione di proteine, permettendo il confronto quantitativo tra più campioni. Utilizzando questo metodo, siamo stati in grado di differenziare le proteine fosforilate in wild-type contro le cellule mitocondri mirati mutanti CDK1 che esprimono. Gli spot proteici specifici che hanno mostrato nel tipo cinghiale ma mancavano nel mutante di preparazione Cdk1 mitocondri mirati sono stati isolati eidentificati tramite spettrometria di massa.
In gel 2D tradizionali, coloranti trifenilmetano vengono utilizzati per visualizzare le proteine sul gel. 2D-DIGE utilizza etichette proteina fluorescente con un effetto minimo sulla mobilità elettroforetica delle proteine. Diversi campioni proteici possono essere etichettati con coloranti fluorescenti differenti, mescolati insieme e separate da gel identiche, consentendo co-elettroforesi di campioni multipli in un unico gel 16. Questo minimizza le variazioni gel-to-gel, che è un problema critico nella proteomica studi a base di gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come le proteine destinate ad altri organuli subcellulari, le proteine mitocondriali mirato possiedono segnali di targeting all'interno della loro struttura primaria o secondaria che li dirigono al organello con l'assistenza di translocating proteine elaborato e piegatrici 21,22. I mitocondri di targeting sequenze (MTS) ottenuti da proteine residenti esclusivamente mitocondriali come COX8 possono essere aggiunti al N-terminale della sequenza di gene bersaglio specifiche protein…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
References
- Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
- Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
- Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
- Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
- Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
- Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
- Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
- Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
- Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
- Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
- Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
- Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
- Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3′-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
- Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic ‘click’ reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
- Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
- Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25 (2009).
- Davies, D., Macey, M. G. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. , 257-276 (2007).
- van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
- Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
- Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
- Karniely, S., Pines, O. Single translation–dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
- Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
- Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341 (2010).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
- Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
- Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).
