Eksperimentelle tilnærminger til å studere mitokondrie lokalisering og funksjon for en kjernefysisk Cell Cycle Kinase, Cdk1
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
I pattedyr, er cellesyklusprogresjon avhenger sterkt organisert hendelser som styres av cykliner og cyklin-avhengige kinaser (CDK'er) 1. Gjennom sitt cytoplasma, kjernekraft, og centrosomal lokalisering, er CyclinB1 / Cdk1 i stand til å synkronisere ulike hendelser i mitosen som kjernekraft konvolutt sammenbrudd og sentrosomen separasjon to. CyclinB1 / Cdk1 beskytter mitotiske celler mot apoptose 3 og fremmer mitokondrie fisjon, et avgjørende skritt for en lik fordeling av mitokondriene til de nydannede dattercellene 4.
I prolifererende mammalske celler blir mitokondriell ATP genereres via oksidativ fosforylering (OXPHOS) maskiner (elektrontransportkjeden), som er sammensatt av 5 fler subenhet-komplekser; kompleks I – kompleks V (CI-CV). Nikotinamidadenindinukleotid (NADH): ubiquinone oksidoreduktase eller kompleks I (CI) er den største og minst forstått av de fem komplekser 5. Komplekset consists av 45 subenheter, 14 som danner det katalytiske kjerne. Når sammenstilt, i komplekset forutsetter en L-formet struktur med en arm som rager inn i matrisen, og den andre armen innleiret i den indre membranen 6,7. Mutasjoner i CI subenheter er årsaken til en rekke mitokondrie lidelser 8. En funksjonelt effektiv CI i OXPHOS er nødvendig ikke bare for total mitokondriell respirasjon 9, men også for vellykket cellesyklusprogresjon 10. Unravelling mekanismene bak bruken av denne membranbundet enzymkompleks i helse og sykdom kan føre til at utvikling av nye diagnostiske prosedyrer og avanserte terapeutiske strategier. I en fersk undersøkelse, har vi funnet at CyclinB1 / Cdk1 kompleks translocates i mitokondriene i (Gap 2) G2 / (Mitosis) M fase og fosforylerer CI underenheter for å forbedre mitokondrieenergiproduksjon, potensielt å kompensere økte energibehovet til celler under celle syklus 11. Her sho viwcase eksperimentelle prosedyrer og strategier som kan brukes til å studere mitokondrietrans av ellers atom / cytoplasma kinaser, deres mitokondrielle underlag samt funksjonelle konsekvenser av deres mitokondrie lokalisering ved hjelp CyclinB1 / Cdk1 som et eksempel.
Den finne at CyclinB1 / Cdk1 kompleks translocates i mitokondriene ved behov førte til at studier av mitokondriene spesifikke overekspresjon og knockdown av dette komplekset. For å oppnå mitokondrier-spesifikk ekspresjon av proteiner, kan man legge til en mitokondrier målretting sekvens (MTS) i den N-terminale ende av proteinet av interesse. Mitokondrier rettet mot sekvenser tillate sortering av mitokondrie proteiner til mitokondriene hvor de normalt bor 12. Vi har brukt en 87 basis mitokondrier målretting sekvens dannet fra forstadiet av humant cytokrom c oksidase subenheten 8A (COX8) og klonet den inn i grønt fluorescerende protein (GFP) -tagged CyclinB1 eller Red FluorescerendeProtein (RFP) -tagged Cdk1 inneholder plasmider i rammen. Denne metoden tillot oss å målrette CyclinB1 og Cdk1 inn i mitokondriene, spesielt endring av mitokondrie uttrykk for disse proteinene uten at det påvirker deres atom bassenget. Ved fluorescens merking disse proteinene, var vi i stand til å overvåke deres lokalisering i sanntid. Tilsvarende har vi innført MTS inn i et plasmid som inneholder RFP-merket dominant negativ Cdk1, som tillater oss å spesifikt slå ned mitokondrie uttrykk og funksjoner Cdk1. Det er viktig å skille mellom mitokondrielle og atom funksjoner av kinaser som har to lokaliseringer som Cdk1. Ingeniør MTS til N-terminalen i disse to funksjonelle kinaser har en god strategi som er lett å bli anvendt og effektiv.
Siden Cdk1 er en cellecyklus-kinase, er det grunnleggende for å bestemme den cellesyklusprogresjon når Cdk1 er lokalisert til mitokondriene. For å oppnå dette, har vi benyttet en ny metod å overvåke DNA-innhold i celler. Tradisjonelle metoder inkluderer bruk av BrdU (bromdeoksyuridin), en syntetisk analog tymidin, som inkorporerer inn i den nysyntetiserte DNA i S-fasen av cellesyklus for å erstatte tymidin. Da cellene som er aktivt replikerende deres DNA kan påvises ved anvendelse av anti-BrdU-antistoff. En ulempe ved denne metoden er at den krever denaturering av DNA for å gi adgang for BrdU-antistoff ved harde metoder som syre eller varmebehandling, noe som kan føre til inkonsistens mellom resultater 13,14. Alternativt, benyttet vi en lignende tilnærming til å overvåke aktivt delende celler med en annen tymidin analog, Edu. Edu deteksjon krever ikke harde DNA denaturering som mildt vaskemiddel behandling gjør at deteksjonsreagensen å få tilgang til Edu i nylig syntetisert DNA. EDU metoden har vist seg å være mer pålitelig, konsistent og med potensial for høy gjennomstrømming analyse 15.
Til slutt, to bestemme mitokondrie substrater av Cdk1, brukte vi en proteomikk verktøy kalt 2D-DIGE, som er en avansert versjon av klassiske to-dimensjonal elektroforese. Todimensjonal elektroforese separerer proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt i den første dimensjon og molekylvekt i den andre. Etter post-translasjonelle modifikasjoner så som fosforylering påvirke det isoelektriske punkt og molekylvekt av proteinene, kan 2D-geler detektere forskjellene mellom fosforylering statusene til proteiner i forskjellige prøver. Størrelsen (område og intensitet) av protein ble endringer med uttrykket nivå av proteiner, slik kvantitativ sammenligning mellom flere prøver. Ved hjelp av denne metoden, var vi i stand til å skille de fosforylerte proteiner i villtype versus mutante mitokondrier målrettet Cdk1 uttrykker celler. De spesifikke protein flekker som viste i villtypen, men manglet i mitokondriene målrettede mutant Cdk1 forberedelse ble isolert ogidentifisert via massespektrometri.
I tradisjonelle 2D geler, blir trifenylmetanfargestoffer brukt til å visualisere proteinene på gelen. 2D-DIGE bruker fluorescerende protein etiketter med minimal effekt på protein elektromobilitet. Forskjellige proteinprøver kan merkes med forskjellige fluorescerende fargestoffer, blandet sammen og adskilt ved de samme gelene, slik at ko-elektroforese av flere prøver på en enkelt gel 16. Dette minimaliserer gel-til-gel variasjoner, som er et kritisk problem i gel-baserte proteomics studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
I likhet med proteiner bestemt for andre subcellulære organeller, mitokondrie målrettet proteiner besitter målrettingsignaler innenfor deres primære eller sekundære struktur som henvise dem til organeller med hjelp av forseggjorte protein translocating og folding maskiner 21,22. Mitokondrier målretting sekvenser (MTS) hentet fra utelukkende mitokondrielle bosatt proteiner som COX8 kan legges til N-terminalen av noen gensekvensen å målrette spesifikke proteiner inn i mitokondriene 11,23,24. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
References
- Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
- Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
- Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
- Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
- Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
- Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
- Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
- Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
- Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
- Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
- Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
- Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
- Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3′-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
- Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic ‘click’ reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
- Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
- Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25 (2009).
- Davies, D., Macey, M. G. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. , 257-276 (2007).
- van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
- Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
- Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
- Karniely, S., Pines, O. Single translation–dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
- Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
- Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341 (2010).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
- Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
- Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).
