Abordagens experimentais para estudar mitocondrial Localização e função de um ciclo celular Nuclear Kinase, Cdk1
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
Nos mamíferos, a progressão do ciclo celular é dependente de acontecimentos altamente ordenadas controlados por ciclinas e cinases dependentes de ciclina (CDK) 1. Através de sua citoplasmático, nuclear, e localização centrosomal, CyclinB1 / Cdk1 é capaz de sincronizar diferentes eventos na mitose, tais como quebra envelope nuclear e separação centrossoma 2. CyclinB1 / Cdk1 protege as células mitóticas contra a apoptose 3 e promove a fissão mitocondrial, um passo crítico para uma distribuição igual das mitocôndrias das células filhas recém-formados 4.
Em proliferação de células de mamíferos, mitocondrial de ATP é gerado através da fosforilação oxidativa (FOX) construção (cadeia de transporte de electrões), o qual é composto por 5 complexos de multi-subunidades; Complexo I – V complexo (CI-CV). Nicotinamida adenina dinucleótido (NADH): oxidorredutase ubiquinona ou complexo I (CI) é a maior e menos compreendido dos cinco complexos de 5. O complexo Consists de 45 subunidades, das quais 14 formam o núcleo catalítico. Uma vez montado, o complexo assume uma estrutura em forma de L com um braço saliente na matriz e o outro braço incorporado na membrana interna 6,7. Mutações em subunidades de IC são a causa de uma variedade de doenças mitocondriais 8. Um IC funcionalmente eficiente em OXPHOS é necessário não só para a respiração mitocondrial geral 9, mas também para a progressão do ciclo celular bem sucedida 10. Unravelling os mecanismos subjacentes ao funcionamento deste complexo de enzima ligada à membrana na saúde e na doença pode permitir o desenvolvimento de novos processos de diagnóstico e estratégias terapêuticas avançadas. Em um estudo recente, verificou-se que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria na / (mitose) fase M (Gap 2) G2 e fosforila subunidades CI para aumentar a produção de energia mitocondrial, potencialmente, para compensar o aumento das necessidades energéticas das células durante celular ciclo de 11. Aqui nós showcase procedimentos experimentais e estratégias que podem ser usados para estudar a translocação mitocondrial de cinases em contrário nucleares / citoplasmáticas, os seus substratos mitocondriais, bem como consequências funcionais da sua localização mitocondrial usando CyclinB1 / Cdk1 como um exemplo.
A constatação de que o / complexo Cdk1 CyclinB1 transloca para dentro da mitocôndria, quando necessário solicitado os estudos de sobre-expressão específicas de mitocôndrias e knockdown deste complexo. Para conseguir a expressão específica de mitocôndrias de proteínas, pode-se adicionar uma sequência de direccionamento mitocondrial (MTS) no N-terminal da proteína de interesse. Mitocôndrias alvo sequências permitem a ordenação das proteínas mitocondriais na mitocôndria onde eles residem normalmente 12. Temos usado uma sequência de direccionamento 87 mitocôndrias de base derivado do precursor do citocromo humano subunidade c oxidase 8A (COX8) e clonado-lo em Green Fluorescent Protein (GFP) tagged CyclinB1 ou vermelho fluorescenteProtein (RFP) tagged Cdk1 contendo plasmídeos no quadro. Este método permitiu-nos atingir CyclinB1 e Cdk1 na mitocôndria, que alterou a expressão mitocondrial destas proteínas sem afetar sua piscina nuclear. Por fluorescente marcação destas proteínas, fomos capazes de monitorar a sua localização em tempo real. Da mesma forma, nós introduzimos MTS em um plasmídeo contendo marcado-RFP dominante negativo Cdk1, o que nos permitiu bater especificamente para baixo a expressão mitocondrial e funções de Cdk1. É essencial para distinguir entre as funções mitocondriais e nucleares das quinases que têm localizações dupla como Cdk1. Engenharia MTS para o N-terminal destas cinases funcionais duais oferece uma grande estratégia que é fácil de ser utilizado e eficaz.
Desde Cdk1 é uma quinase do ciclo celular, que é fundamental para determinar a progressão do ciclo celular quando Cdk1 está localizada dentro da mitocôndria. Para conseguir isso, nós utilizamos uma nova metod para monitorizar o conteúdo em ADN em células. Os métodos tradicionais incluem a utilização de BrdU (bromodesoxiuridina), um análogo da timidina sintética, que incorpora-se no ADN sintetizado de novo durante a fase S do ciclo celular para substituir timidina. Em seguida, as células que estão a replicar o seu DNA activamente pode ser detectada utilizando anticorpos anti-BrdU. Uma desvantagem deste método é que ele exige a desnaturação de ADN para fornecer acesso para o anticorpo BrdU por métodos agressivos como tratamento com ácido ou calor, o que pode resultar em inconsistência entre os resultados 13,14. Alternativamente, utilizou-se uma abordagem semelhante para monitorar as células que se dividem activamente com um análogo da timidina diferente, EdU. detecção EdU não requer desnaturação DNA dura como o tratamento detergente suave permite que o reagente de detecção para acessar o EdU no DNA recém-sintetizado. O método EdU provou ser mais confiável, consistente e com potencial para a análise de alto rendimento 15.
Finalmente, to determinar os substratos mitocondriais de Cdk1, usamos uma ferramenta proteômica chamado 2D DIGE, que é uma versão avançada do eletroforese em gel clássico bidimensional. Electroforese bidimensional separa as proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico na primeira dimensão e o peso molecular na segunda. Uma vez que as modificações pós-traducionais, tais como fosforilação afectar o ponto isoeléctrico e o peso molecular das proteínas, géis 2D podem detectar diferenças entre os estados de fosforilação de proteínas nas amostras diferentes. O tamanho (área e intensidade) de proteína acaba alterações com o nível de expressão de proteínas, permitindo a comparação quantitativa entre múltiplas amostras. Usando este método, fomos capazes de diferenciar as proteínas fosforiladas no tipo selvagem contra células que expressam CDK1 segmentada por mitocôndrias mutantes. Os spots de proteínas específicas que mostraram no tipo selvagem, mas estavam faltando no mutante preparação Cdk1 segmentada por mitocôndrias foram isoladas eidentificado através de espectrometria de massa.
Nos geles 2D tradicionais, corantes de trifenilmetano são utilizados para visualizar as proteínas no gel. 2D DIGE usa rótulos proteína fluorescente com um efeito mínimo sobre a mobilidade eletroforética de proteínas. Diferentes amostras de proteínas podem ser marcados com diferentes corantes fluorescentes, misturados entre si e separadas por os géis idênticos, permitindo que a co-electroforese de amostras múltiplas com uma única gel 16. Isto minimiza as variações de gel-a-gel, o que é um problema crítico nos estudos proteómica à base de gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Como as proteínas destinadas para outros organelos subcelulares, proteínas mitocondriais possuem sinais alvo específicas no interior da sua estrutura primária ou secundária que os dirigem para o organelo, com a assistência de translocação de proteína elaborada e máquinas de dobragem 21,22. As mitocôndrias sequências de direccionamento (MTS) obtidos a partir de proteínas residentes exclusivamente mitocondriais tais como COX8 pode ser adicionado ao terminal-N de qualquer sequência de genes para pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
References
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