Experimentella metoder för att studera mitokondrie Lokalisering och funktion av en kärnteknisk Cell Cycle kinas, Cdk1
Summary
Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.
Abstract
Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.
Introduction
Hos däggdjur är cellcykelprogression beroende av höggradigt ordnade händelser som kontrolleras av cykliner och cyklinberoende kinaser (CDK: er) 1. Genom sin cytoplasma, kärnkraft, och centrosomal lokalisering, är CyclinB1 / Cdk1 kunna synkronisera olika händelser i mitos såsom kärnhöljet uppdelning och centrosom separation 2. CyclinB1 / Cdk1 skyddar mitotiska celler mot apoptos 3 och främjar mitokondriell fission, ett viktigt steg för en jämn fördelning av mitokondrier till nybildade dottercellerna 4.
I prolifererande däggdjursceller, är mitokondriella ATP genereras via oxidativ fosforylering (OXPHOS) maskiner (elektrontransportkedja), som består av 5 fler subenhet komplex; komplexa I – komplex V (CI-CV). Nikotinamidadenindinukleotid (NADH): ubikinon oxidoreduktas eller komplexa I (CI) är den största och minst förstådda av de fem komplexen 5. Komplexet consists av 45 subenheter, varav 14 bildar den katalytiska kärnan. En gång monterade, den komplexa antar en L-formad struktur med en arm som skjuter in i matrisen och den andra armen är inbäddad i det inre membranet 6,7. Mutationer i CI subenheter är orsaken till en mängd olika mitokondriella sjukdomar 8. En funktionellt effektiv CI i OXPHOS krävs inte bara för den övergripande mitokondrie andning 9, men även för framgångsrik cellcykelprogression 10. Unravelling mekanismerna bakom hur detta membranbundna enzymkomplexet i hälsa och sjukdom kan möjliggöra utveckling av nya diagnostiska metoder och avancerade terapeutiska strategier. I en nyligen genomförd studie, har vi funnit att CyclinB1 / Cdk1 komplex translokerar till mitokondrier i (Gap 2) G2 / (Mitos) M-fas och fosforylerar CI subenheter att öka mitokondriella energiproduktionen, potentiellt för att kompensera ökade behov av celler energi under cell cykel 11. Här sho viwcase experimentella procedurer och strategier som kan användas för att studera mitokondriella translokation av annars kärn / cytoplasmiska kinaser, deras mitokondriella substrat samt funktionella konsekvenserna av deras mitochondrial lokalisering med hjälp av CyclinB1 / Cdk1 som ett exempel.
Upptäckten att CyclinB1 / Cdk1 komplex translokerar i mitokondrier när det behövs uppmanas studier av mitokondrier specifika uttryck och knockdown av denna komplexa. Att uppnå mitokondrier specifik expression av proteiner, kan en lägga till en mitokondrier målsekvens (MTS) i den N-terminalen av proteinet av intresse. Mitokondrier är inriktade sekvenser tillåter sortering av mitokondriella proteiner i mitokondrierna där de normalt är bosatta 12. Vi har använt en 87 bas mitokondrier targeting sekvens härledd från prekursorn av human cytokrom c oxidas subenhet 8A (COX8) och klonades den in i grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt CyclinB1 eller Red FluorescentProtein (RFP)-märkt Cdk1 innehållande plasmider i ram. Denna metod tillät oss att rikta CyclinB1 och Cdk1 in i mitokondrierna, specifikt förändras den mitokondriella expression av dessa proteiner utan att påverka deras nukleära pool. Genom fluorescerande märka dessa proteiner, kunde vi följa deras lokalisering i realtid. På samma sätt har vi infört MTS i en plasmid innehållande RFP-märkta negativ dominant Cdk1, som tillät oss att specifikt slå ner den mitokondriella uttryck och funktioner Cdk1. Det är väsentligt att skilja mellan mitokondriella och nukleära funktionerna hos de kinaser som har dubbla lokaliseringar som Cdk1. Engineering MTS till N-terminalen av dessa dubbla funktionella kinaser har en bra strategi som är lätt att vara anställd och effektiv.
Eftersom Cdk1 är en cellcykel kinas, är det fundamentalt för att bestämma cellcykelprogression när Cdk1 är lokaliserad i mitokondrier. För att uppnå detta har vi använt en ny metod för att övervaka DNA-innehållet i celler. Traditionella metoder innefattar användning av BrdU (bromdeoxiuridin), en syntetisk tymidin-analog, som inkorporerar in i det nyligen syntetiserade DNA under S-fasen av cellcykeln för att ersätta tymidin. Då cellerna som aktivt replikerande deras DNA kan detekteras med användning av anti-BrdU-antikroppar. En nackdel med denna metod är att den kräver denaturering av DNA för att ge tillträde för BrdU antikropp genom hårda metoder som syra eller värmebehandling, vilket kan resultera i inkonsekvens mellan resultat 13,14. Alternativt, utnyttjade vi en liknande metod för att övervaka aktivt delande celler med olika tymidinanalog, edu. Edu detektion kräver inte hårda DNA denaturering som mild behandling tvättmedel möjliggör detektion reagens för att komma åt edu i nyligen syntetiserade DNA. ENE metoden har visat sig vara mer tillförlitlig, konsekvent och med potential för hög genomströmning analys 15.
Slutligen to bestämma mitokondriella substrat av Cdk1 använde vi ett proteomik verktyg som heter 2D-DIGE, som är en avancerad version av klassiska tvådimensionell gelelektrofores. Tvådimensionell elektrofores separerar proteiner i enlighet med deras isoelektriska punkt i den första dimensionen och molekylvikt i den andra. Eftersom posttranslationella modifieringar såsom fosforylering påverkar den isoelektriska punkten och molekylvikten av proteinerna, kan 2D-geler detektera skillnaderna mellan fosforyleringsställen tillstånden hos proteiner i olika prover. Storleken (area och intensitet) av proteinfläckar förändringar med expressionsnivån av proteiner, vilket möjliggör kvantitativ jämförelse mellan multipla prover. Med denna metod kunde vi skilja fosforylerade proteiner i vildtyp kontra muterade mitokondrier riktade CDK1 uttryckande celler. De specifika proteinfläckar som visade i vildtypen men saknades i mitokondrierna inriktade mutant Cdk1 förberedelse isolerades ochidentifieras via masspektrometri.
I traditionella 2D geler är trifenylmetanpigment färgämnen används för att visualisera proteinerna på gelén. 2D-DIGE använder fluorescerande protein etiketter med minimal effekt på protein elektro rörlighet. Olika proteinprover kan märkas med olika fluorescerande färgämnen, blandade med varandra och separerade av de identiska geler, vilket gör att samtidig elektrofores av flera prover på en enda gel 16. Detta minimerar de gel-till-gel-variationer, vilket är ett kritiskt problem i gelbaserade proteomikstudier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Liksom de proteiner som är avsedda för andra subcellulära organeller, mitokondriella riktade proteiner har inriktnings signaler inom deras primära eller sekundära struktur som leder dem till organellen med hjälp av genomarbetade protein translokerande och fällbara maskiner 21,22. Mitokondrier målsökningssekvenser (MTS), som erhölls från enbart mitokondriella bosatta proteiner såsom COX8 kan tillsättas till N-terminalen i varje gensekvens att inrikta sig på specifika proteiner in i mitokondrierna…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants CA133402, CA152313 and Department of Energy Office of Science DE-SC0001271. We thank the University of California Davis Flow Cytometry Shared Resource Laboratory with funding from the NCI P30 CA0933730, and NIH NCRR C06-RR12088, S10 RR12964 and S10 RR 026825 grants and with technical assistance from Ms. Bridget McLaughlin and Mr. Jonathan Van Dyke for their help with the flow cytometry experiments.
Materials
| 32P ATP | PerkinElmer | BLU002001MC | |
| Anti-mouse secondary antibody | Invitrogen | A-11003 | Alexa-546 conjugated |
| Anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11029 | Alexa-488 conjugated |
| ATP | Research Organics | 1166A | For in vitro kinase assay |
| Cdk1 antibody | Cell Signaling Technology | 9112 | |
| Cdk1 kinase buffer | New England Biolabs | P6020S | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Life Technologies | C10337 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| COX IV antibody | Cell Signaling Technology | 4844S | For mitochondrial immunostaining |
| Cyclin B1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-752 | |
| CyclinB1/Cdk1 enzyme complex | New England Biolabs | P6020S | Avoid freeze/thaw |
| CyDye DIGE Fluor Labeling Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25-8009-83 | |
| DIGE Gel and DIGE Buffer Kit | GE Healthcare Life Sciences | 28-9480-26 AA | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 319937 | DMF |
| Dithiothreitol | Bio-Rad | 161-0611 | DTT |
| dNTP | EMD Millipore | 71004 | For site-directed mutagenesis |
| Dpn I enzyme | Stratagene | 200519-53 | For site-directed mutagenesis |
| Dry Strip cover fluid | GE Healthcare Life Sciences | 17-1335-01 | Used as mineral oil |
| EDTA | J.T. Baker | 4040-03 | |
| EGTA | Acros Organics | 409910250 | |
| Eppendorf Vacufuge Concentrator | Fisher Scientific | 07-748-13 | Used as vacuum centrifuge concentrator |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | Anti-fade mounting solution |
| Fortessa Flow Cytometer | BD Biosciences | 649908 | For cell cycle analysis with EdU labeling |
| Histone H1 | Calbiochem | 382150 | For in vitro kinase assay |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For purifying DNA fragments from agarose gels |
| Immobiline DryStrip Gels | GE Healthcare Life Sciences | 18-1016-61 | IEF (isoelectric focusing) strips |
| Immobilized Glutathione | Thermo Scientific | 15160 | Glutathione-agarose beads |
| Iodoacetamide | Sigma Aldrich | I1149 | IAA |
| IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE Healthcare Life Sciences | 11-0033-64 | IPGphor strip holders |
| Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside | RPI Corp | 156000-5.0 | IPTG |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L9783 | For cell lysis buffer |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Transfection reagent |
| Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | For CyDye labeling |
| Lysozyme | EMD Chemicals | 5960 | |
| Mitoctracker Red/Green | Invitrogen | M7512/M7514 | Mitochondrial fluorescent dyes |
| MOPS | EMD Chemicals | 6310 | |
| pEGFP-N1 | Clonetech | 6085-1 | GFP-expressing vector |
| Pfu | Stratagene | 600-255-52 | |
| pGEX-5X-1 | GE Healthcare Life Sciences | 28-9545-53 | GST-expressing vector |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Shelton Scientific | IB01090 | PMSF |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040 | PBS |
| Spectra/Por 4 dialysis tubing | Spectrum Labs | 132700 | as porous membrane tubing for dialysis |
| Pro-Q Diamond Phosphoprotein Gel Stain | Life Technologies | P-33300 | For staining phosphoproteins on 2D gels |
| Proteinase inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | For cell lysis buffer |
| QuikChange site-directed mutagenesis kit | Stratagene | 200519-5 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | MiniPrep Plasmid Isolation Kit |
| RO-3306 | Alexis Biochemicals | 270-463-M001 | Cdk1 inhibitor |
| Rotenone | MP Biomedicals | 150154 | Complex I inhibitor |
| Sodium carbonate | Fisher Scientific | S93359 | |
| Sodium chloride | EMD Chemicals | SX0420-5 | For cell lysis buffer |
| Sodium orthovanadate | MP Biomedicals | 159664 | For cell lysis buffer |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Alfa Aesar | 33385 | For cell lysis buffer |
| Sodium β-glycerophosphate | Alfa Aesar | L03425 | For cell lysis buffer |
| SpectraMax M2e | Molecular Devices | M2E | Microplate reader |
| Sucrose | Fisher Scientific | 57-50-1 | |
| Tissue Grinder pestle | Kimble Chase | 885301-0007 | For mitochondria isolation |
| Tissue Grinder tube | Kimble Chase | 885303-0007 | For mitochondria isolation |
| Trichloroacetic acid solution | Sigma Aldrich | T0699 | TCA |
| Tris | MP Biomedicals | 103133 | |
| Triton-x-100 | Teknova | T1105 | |
| Trypsin | Calbiochem | 650211 | |
| Typhoon Imager | GE Healthcare Life Sciences | 28-9558-09 | Laser gel scanner fro 2D-DIGE |
| Ubiquinone | Sigma Aldrich | C7956 |
References
- Weinert, T., Hartwell, L. Control of G2 delay by the rad9 gene of Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci Suppl. 12, 145-148 (1989).
- Takizawa, C. G., Morgan, D. O. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C. Curr Opin Cell Biol. 12 (6), 658-665 (2000).
- Allan, L. A., Clarke, P. R. Phosphorylation of caspase-9 by CDK1/cyclin B1 protects mitotic cells against apoptosis. Mol Cell. 26 (2), 301-310 (2007).
- Cerveny, K. L., Tamura, Y., Zhang, Z., Jensen, R. E., Sesaki, H. Regulation of mitochondrial fusion and division. Trends Cell Biol. 17 (11), 563-569 (2007).
- Brandt, U. Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annu Rev Biochem. 75, 69-92 (2006).
- Hofhaus, G., Weiss, H., Leonard, K. Electron microscopic analysis of the peripheral and membrane parts of mitochondrial NADH dehydrogenase (complex I). J Mol Biol. 221 (3), 1027-1043 (1991).
- Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., Preis, D. The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur J Biochem. 197 (3), 563-576 (1991).
- Janssen, R. J., Nijtmans, L. G., van den Heuvel, L. P., Smeitink, J. A. Mitochondrial complex I: structure, function and pathology. J Inherit Metab Dis. 29 (4), 499-515 (2006).
- Roessler, M. M., et al. Direct assignment of EPR spectra to structurally defined iron-sulfur clusters in complex I by double electron-electron resonance. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (5), 1930-1935 (2010).
- Owusu-Ansah, E., Yavari, A., Mandal, S., Banerjee, U. Distinct mitochondrial retrograde signals control the G1-S cell cycle checkpoint. Nat Genet. 40 (3), 356-361 (2008).
- Wang, Z., et al. Cyclin B1/Cdk1 coordinates mitochondrial respiration for cell-cycle G2/M progression. Dev Cell. 29 (2), 217-232 (2014).
- Omura, T. Mitochondria-targeting sequence, a multi-role sorting sequence recognized at all steps of protein import into mitochondria. J Biochem. 123 (6), 1010-1016 (1998).
- Konishi, T., Takeyasu, A., Natsume, T., Furusawa, Y., Hieda, K. Visualization of heavy ion tracks by labeling 3′-OH termini of induced DNA strand breaks. J Radiat Res. 52 (4), 433-440 (2011).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry A. 58 (1), 45-52 (2004).
- Li, K., Lee, L. A., Lu, X., Wang, Q. Fluorogenic ‘click’ reaction for labeling and detection of DNA in proliferating cells. Biotechniques. 49 (1), 525-527 (2010).
- Kondo, T., et al. Application of sensitive fluorescent dyes in linkage of laser microdissection and two-dimensional gel electrophoresis as a cancer proteomic study tool. Proteomics. 3 (9), 1758-1766 (2003).
- Gundry, R. L., et al. Chapter 10, Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow. Curr Protoc Mol Biol. , Unit 10.25 (2009).
- Davies, D., Macey, M. G. Chapter 11, Cell Sorting by Flow Cytometry. Flow Cytometry. , 257-276 (2007).
- van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
- Terry, N. H. A., White, R. A. Flow cytometry after bromodeoxyuridine labeling to measure S and G2+M phase durations plus doubling times in vitro and in vivo. Nat. Protcols. 1 (2), 859-869 (2006).
- Becker, L., et al. Preprotein translocase of the outer mitochondrial membrane: reconstituted Tom40 forms a characteristic TOM pore. J Mol Biol. 353 (5), 1011-1020 (2005).
- Karniely, S., Pines, O. Single translation–dual destination: mechanisms of dual protein targeting in eukaryotes. EMBO Rep. 6 (5), 420-425 (2005).
- Candas, D., et al. CyclinB1/Cdk1 phosphorylates mitochondrial antioxidant MnSOD in cell adaptive response to radiation stress. J Mol Cell Biol. 5 (3), 166-175 (2013).
- Nantajit, D., et al. Cyclin B1/Cdk1 phosphorylation of mitochondrial p53 induces anti-apoptotic response. PLoS One. 5 (8), e12341 (2010).
- Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. A novel method based on click chemistry, which overcomes limitations of cell cycle analysis by classical determination of BrdU incorporation, allowing multiplex antibody staining. Cytometry A. 73 (7), 626-636 (2008).
- Niwa, H., et al. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13617-13622 (1996).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Marouga, R., David, S., Hawkins, E. The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology. Anal Bioanal Chem. 382 (3), 669-678 (2005).
- Timms, J. F., Cramer, R. Difference gel electrophoresis. Proteomics. 8 (23-24), 4886-4897 (2008).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. BD Biosciences Appl Notes. , (2011).
