Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

Summary

A camada externa de grânulo cerebelar é o local da maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento. Aqui, apresentamos um protocolo para direcionar modificação genética a esta camada no pico de proliferação utilizando ex eletroporação vivo e cultura de fatias de cerebelo a partir do dia 14 embriões de galinha embrionárias.

Abstract

A camada externa de grânulo cerebelar (EGL) é o local de maior amplificação de trânsito no cérebro em desenvolvimento, e um excelente modelo para estudar a proliferação e diferenciação neuronal. Além disso, as modificações evolutivas da sua capacidade proliferativa ter sido responsável pela dramática expansão do tamanho do cerebelo nas amniotes, tornando o cerebelo um excelente modelo para estudos evo-devo do cérebro dos vertebrados. As células constituintes da EGL, progenitores de grânulos de cerebelo, também representam um celular significativa de origem para meduloblastoma, o tumor neuronal pediátrica mais prevalente. A seguir à amplificação de trânsito, os precursores de grânulos migrar radialmente para dentro da camada granular interna do cerebelo, onde eles representam a maior população de neurónios no cérebro de mamíferos madura. Em pintainho, o pico de proliferação EGL ocorre no final da segunda semana de gestação. A fim de direccionar a modificação genética para esta camada emo pico de proliferação, temos desenvolvido um método para a manipulação genética ex vivo através de electroporação de fatias do cerebelo a partir do Dia 14 embriões de pintos embrionários. Este método recapitula vários aspectos importantes da in vivo de grânulos desenvolvimento neuronal e será útil para gerar uma compreensão completa da proliferação de células granulares do cerebelo e diferenciação, e, portanto, do desenvolvimento do cerebelo, e a evolução da doença.

Introduction

O cerebelo fica no final anterior da parte posterior do cérebro e é responsável pela integração do processamento sensorial e motor no cérebro maduro, bem como regulando processos cognitivos superiores ^1. Nos mamíferos e aves, que possui uma morfologia elaborada e é fortemente foliados, um produto de grande amplificação trânsito de progenitores durante o desenvolvimento, que produz mais de metade dos neurónios no cérebro adulto. O cerebelo tem sido um tema de estudo para os neurobiólogos durante séculos e na era molecular recebeu igualmente uma atenção significativa. Isto diz respeito não só à sua biologia inerentemente interessante, mas também ao fato de que ele é fortemente implicado na doença humana, incluindo doenças genéticas de desenvolvimento, como transtornos do espectro do autismo ^{2 e} mais proeminente o câncer cerebelar, meduloblastoma ^{3, que é} o cérebro pediátrico mais prevalente tumor. Importante, é um excelente sistema de modelo dentro which para estudar alocação destino e neurogênese durante o desenvolvimento cerebral ^4. Nos últimos anos, foi também estabelecida como um sistema modelo para o estudo comparativo de desenvolvimento do cérebro, devido à grande diversidade de formas de cerebelo visto do outro lado da filogenia vertebrado ^5-10.

O cerebelo desenvolve a partir da metade dorsal da rhombomere 1 no cérebro posterior ¹¹ e desenvolvente é composta de duas populações progenitoras primárias, o lábio rômbica e da zona ventricular. O lábio rhombic se estende em torno da região dorsal do neuroepitélio da hindbrain na fronteira com a placa de telhado. É o berço dos neurônios excitatórios glutamatérgicos do cerebelo ^12-14. A zona ventricular dá origem a neurônios do cerebelo GABAérgicos inibitórios, o mais proeminente os neurônios de Purkinje grandes ^14,15. Mais tarde, em desenvolvimento (de cerca dia embrionário 13,5 em rato; e6 em pinto ^16), Progen glutamatergicitors migrar tangencialmente a partir do lábio rômbica e formar uma camada de células progenitoras pial: uma zona secundária chamada de progenitor a camada externa de grânulo (EGL). É esta camada que sofre a grande amplificação de trânsito que leva para o grande número de neurônios granulares encontrados no cérebro maduro.

Proliferação na EGL tem sido ligada à localização sub-pial que resulta da migração tangencial do lábio rômbico ^17, com o interruptor para sair do ciclo celular e diferenciação neuronal de células progenitoras estarem associados com a sua saída a partir da camada exterior EGL para o meio EGL ^18. Migração tangencial extensivo de células granulares pós-mitóticas no eixo lateral-medial ocorre no médio e interno EGL ^19, antes da migração radial final para a camada de grânulos interior do córtex cerebelar maduro. A migração de células a partir do lábio rômbico sobre a superfície do cerebelo é dependente da sinalização da CXCL12 Pia ^20-22 </sup> E células de grânulos de expressar o receptor CXCR4 CXCL12. Sua migração tangencial é, portanto, lembra a dos tangencialmente neocortical migrando populações interneurônio inibitórios ^23-25. Curiosamente, elétrons estudos microscópicos ¹⁷ sugeriram que as células EGL com uma morfologia proliferativa manter contato pial, ligando o comportamento das células com capacidade proliferativa de uma forma que lembra os progenitores basais do córtex dos mamíferos ^26. Isso se reflete na estratificação acima mencionado da EGL em três subcamadas que são definidas por ambientes extracelulares distintas e onde os precursores granulares têm expressão genética distinta assinaturas ^18.

A proliferação de células progenitoras no oEGL ocorre com uma distribuição normal de tamanhos de clones de tal modo que quando são individualmente progenitores geneticamente marcado no final do desenvolvimento embrionário no ratinho, o que dá origem a uma média de 250-500 g mediana pós-mitóticoneurônios ranule ^27,28. Proliferação é dependente de sinalização mitogénica de SHH subjacente Purkinje neurônios ^29-32. A capacidade de responder a Shh foi demonstrado ser totalmente dependente de célula expressão autónoma do factor de transcrição Atoh1, tanto in vitro e in vivo ^{33 34,35.} Da mesma forma, sair do ciclo celular e diferenciação tem sido mostrado para ser dependentes da expressão do factor de transcrição a jusante NeuroD1 ^{36, o qual} é provável que um repressor directo da Atoh1 ^37.

Apesar deste progresso, e avanço considerável em decifrar a base biológica do ciclo celular de células de saída ^38-42, o mecanismo molecular fundamental (s) que estão subjacentes à decisão de sair do ciclo celular e para a transição de um progenitor para um neurónio de diferenciação, e a migração tangencial pós-mitótico associado na EGL interior, bem como o interruptor mais tardea migração radial, permanecem completamente compreendida. Isto é, em grande medida devido ao intractability experimental da EGL: é manifestação tardia, e difícil de atingir uma vez que geneticamente muitas das mesmas moléculas neurogénicos também são cruciais no início da vida de precursores de grânulos no lábio rômbico. Para superar este problema, vários autores desenvolveram in vivo e ex vivo, electroporação, como um método para direccionar o cerebelo pós-natal em roedores ^43-48. Aqui, nós caminho o uso de electroporação em ex vivo para estudar o pintainho EGL, o que representa consideráveis ​​vantagens em termos de custo e comodidade. Nosso método de eletroporação e ex vivo cultura fatia de tecido cerebelar pintainho utiliza tecido dissecado a partir do dia embrionário 14 pintos no pico da proliferação EGL. Este método permite a segmentação genética da EGL independentemente do lábio rhombic e irá definir o cenário para a análise genética da transição do grânuloprogenitoras para neurónios de grânulos pós-mitótico no cerebelo.

Protocol

Nota: Todas as experiências foram realizadas com acordo de Kings College London, Reino Unido e as orientações de cuidados de animais UK Home Office. 1. Dissecção da e14 Cerebelo Incubar ovos de galinha fertilizados marrom a 38 ° C para o dia 14 embrionário. Usando uma tesoura de ovos decapitam embrião de galinha in ovo e remover a cabeça para uma placa de Petri contendo PBS gelado (Figura 1A). Utilizando uma pinça standard, f…

Representative Results

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos utilizando eletroporação fatia e cultura de cerebelo de embrionário Dia 14 do pintinho. A dissecção do cerebelo é ilustrada na Figura 1 e a câmara de electroporação configuração é mostrado na Figura 2. Nós mostramos que é possível electroporate e com sucesso fatias de cerebelo de cultura, que retêm a sua estrutura e morfologias celulares <e…

Discussion

O protocolo aqui relatado descreve um método para a dissecação, electroporating e cultura de fatias de embrionário do dia 14 a partir do cerebelo de pinto. Este protocolo permite a segmentação de eletroporação para pequenas regiões focais do EGL, incluindo isolado direcionamento dos lóbulos do cerebelo individuais. Ele permite a análise genética e de imagem com uma resolução elevada e conveniência, e de baixo custo em comparação com técnicas estabelecidas em roedores ^43-47. Essa análise nã…

Materials

McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicillin/streptomycin	Sigma	P4333
0.4μm culture insert	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.