Chromatin Immunutfelling analyse for identifikasjon av Arabidopsis Protein-DNA interaksjoner<em> I Vivo</em

Summary

Kromatin immunoutfellingen er en kraftfull teknikk for identifisering av DNA-bindende områder av Arabidopsis proteiner in vivo. Denne fremgangsmåten omfatter kromatin tverrbinding og fragmentering, immunopresipitering med selektive antistoffer mot proteinet av interesse, og qPCR-analyse av bundet DNA. Vi beskriver en enkel ChIP assay optimalisert for Arabidopsis planter.

Abstract

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Introduction

I løpet av de senere år har en rekke genetiske, molekylære og genomiske verktøy har blitt utviklet i modellen Arabidopsis thaliana arter. Denne teknologien har mulig enormt fremdriften i å forstå hvordan planteutvikling er regulert. Blant de utviklingsprosesser studert ved hjelp av Arabidopsis som modell, har den genetiske kontrollen av blomstringstid blitt grundig analysert. Disse studiene har vist at planter modulere meget nøyaktig tidspunktet for blomstring som svar på endogene signaler, slik som hormoner og alder av anlegget, og også miljø signaler slik som fotoperiode og temperatur som synkroniserer blomstrende tid med den naturlige syklus av årstider ^{1, 2.} Isolering og karakterisering av Arabidopsis mutanter med endringer i blomstringstidspunktet har vært avgjørende faktor i avduke et komplekst nettverk av gener som regulerer blomstringstid som svar på endogene og miljøfaktorer. Disse genetiske kretser erintegrert på nivå med noen mester gener som fungerer som brytere av blomstring, og det nøyaktige tidspunktet for floral initiering avhenger av balansen av blomstrende fremme og undertrykke aktiviteter som fungerer oppstrøms floral Integrator gener ^1,3.

Den funksjonelle karakterisering av genene identifisert for sin rolle i kontrollen av blomstring initiering, hjulpet av den nylig bruk av genomiske tilnærminger, har åpenbart den sentrale rollen til transkripsjonsregulering i modulering av blomstring tid. Faktisk er mange av master gener blomstring kode transkripsjonsfaktorer ^fire. I tillegg er en rekke av kromatin ombygging proteinkomplekser påvirker ekspresjonen av gener som er av stam blomstring. En rekke av de isolerte mutanter Arabidopsis for deres endrede blomstring tid viste seg å bære mutasjoner i gener som koder for et utvalg av kromatin modifikatorer. Ulike kromatin remodelers som introduserer posttranslational endringer i Histone haler, omplassere nukleosomer forhold til DNA eller utveksle kanoniske histoner av histone variantene er nødvendig for riktig regulering av blomstring i Arabidopsis ^5,6. Noen av disse kromatin remodeling aktivitetene kata deponering eller fjerning av kovalente modifikasjoner slik som acetylering eller metylering i bestemte histon rester. Disse histone merkene er spesielt anerkjent av spesialiserte effektorer som rekrutterer andre kromatin remodeling komplekser, transkripsjonsfaktorer eller komponenter av transkripsjons maskiner for å regulere transkripsjonen aktivitet av blomstrende gener.

Kromatin immunoutfelling (chip) muliggjør identifikasjon av DNA in vivo-bindingsseter for proteiner av interesse (figur 1). Denne prosedyren utnytter evnen av visse kjemikalier for å kryssbinde proteiner til DNA. De resulterende DNA-proteinkomplekser kan deretter immunopresipitert ved hjelp av spesifikke antistoffer against transkripsjonsfaktorer, kromatin-bindende proteiner, eller bestemte modifikasjoner og heterologe epitoper (ofte referert til som "tags") festet til proteinet av valget. DNA ble renset fra disse immunopresipitater kan brukes som et templat i kvantitative PCR (qPCR) reaksjoner for å vurdere for anrikning av bestemte sekvenser av interesse. På denne måten, kan bindingssetene av transkripsjonsfaktorer eller fordeling av histon merker i bestemte gener bli etablert ^7,8. I tillegg kombineres med Next Generation Sequencing (NGS) som gjør at massiv parallell sekvensering, har chip-teknologi gjort mulig genom-wide identifisering av bindingsstedene for transkripsjonsfaktorer samt avduking epigenomic landskapene histonmodifikasjonene. Videre er den samtidige analyse av genekspresjon muliggjør overvåking hvor binding av transkripsjonelle regulatorer eller avsetning av bestemte histon merkene korrelerer med den transkripsjonelle aktivity av gener ^9.

Bruken av chip protokoller i Arabidopsis har gjort det mulig å vurdere virkningen at en rekke forskjellige transkripsjonelle regulatorer har på kromatin organiseringen av master-gener av blomstring og hvordan disse strukturelle endringer påvirker genekspresjon ^5,6. Tidligere resultater viste at Arabidopsis locus TIDLIG bolting I korte dager (EBS) fungerer som en undertrykker av blomstring og mutanter i dette genet viser en akselerasjon av blomstring og oppregulering av master gen av blomstring FT. I tillegg er tap-av-funksjon-mutasjoner i FT fullstendig undertrykke tidlig blomstring fenotypen til EBS mutant planter, noe som indikerer at FT er nødvendig for tidlig blomstring av EBS mutanter og at EBS er nødvendig for undertrykkelse av denne hoved gen av blomstrende ^{10 , 11.} EBS koder for et PHD holdig protein som spesifikt binder histon H3 di- og trimetylert i the lysin 4 rest (H3K4me2 / 3), noe som tyder på en rolle for EBS i kromatin-mediert undertrykking av FT ^12. Bruken av brikken tilnærming vist at Arabidopsis PHD-inneholdende protein EBS ^10,11 binder regulatoriske regioner av blomster integrator genet FT for å undertrykke ekspresjon ^12. Ytterligere data som oppnås ved bruk av chip teknologi viste at dette proteinet er nødvendig for å opprettholde lave nivåer av histon acetylering, et kjennetegn på aktiv transkripsjon, i kromatin av denne hoved genet av blomstring under innledende stadier av Arabidopsis utvikling. Disse observasjonene, sammen med genetisk og genuttrykk data, viser at denne Arabidopsis PHD holdig protein har en sentral rolle i finjustering av blomstringstid ved å modulere uttrykk for floral integrator genet FT ^12. Arbeidet som presenteres her gir en optimalisert metode som er nyttig ikke bare for analyse av histoner, men også for annetkromatin assosierte proteiner, og med økt effektivitet og redusert eksperimentelle tid. Videre viser rapporten hvordan bruken av chip protokoller har gitt ny innsikt i forholdet mellom endringer i kromatin modifikasjoner og transkripsjons tilstander av plantegener, og hvordan disse kromatin-mediert mekanismer for genekspresjon kontroll innvirkning på utbruddet av blomstring i Arabidopsis.

Protocol

1. Fornetting av plantemateriale (1 time) Vokse Arabidopsis linjer som brukes i eksperimentet (villtype – WT – versus mutanter og / eller linjer som uttrykker den kodede versjon av proteinet av interesse i forhold til linjer som uttrykker merkelappen ikke smeltet til ethvert protein) i 12-18 dager i store Petri-skåler (150 mm) med MS-agar-medium (1 L: Murashige og Skoog 1x salter, 10 g sukrose, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% agar). Alternativt, vokser planter på potter som inneholder 3: 1 blanding av jord og v…

Representative Results

Åtte hovedtrinn kan bli utpekt i denne brikken protokoll for identifisering av in vivo protein-DNA-interaksjoner, inkludert dyrking og høsting av plantemateriale, tverrbinding av kromatin, kromatin isolasjon, kromatin fragmentering, selektiv isolering av kompleksene mellom DNA og for proteinet av interesse ved immunoutfelling, protein fordøyelse, DNA-rensing, og qPCR-analyse (figur 1). Et viktig skritt i chip-protokollen er fiksering av DNA-protein interaksjoner i en tverrbindingsre…

Discussion

Brikken Protokollen er beskrevet her er en reproduserbar og kraftfull teknikk for å analysere interaksjoner mellom protein og spesifikke DNA-sekvenser in vivo i Arabidopsis planter. En vellykket identifisering av bindingssteder for proteiner av interesse krever et tilstrekkelig utvalg av plante organer eller utviklingsstadier hvor de relevante interaksjoner er faktisk skjer. I tillegg er det viktig å oppnå en tilstrekkelig fiksering av plantematerialet, og en optimal skjæring av kromatin ved ultralydbehandl…

Materials

MES	Sigma	M8250
MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture)	Sigma	M5524
Formaldehyde 37%	Sigma	F8775-25	Use under the fume hood
Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack	Roche	5892791001
Bioruptor Standard sonication device	Diagenode	B01010002 (UCD200TO)
Glycine	Sigma	50046
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G	Life Technologies	10003D/10001D	Check manufacturer’s manual for antibody affinity
Miracloth	Merck Millipore	475855
Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution	Life Technologies	85112
(mouse, rat, rabbit…)-IgG	Diagenode	C15400001, C15420001, C15410206
Magnetic rack – DynaMag™-2	Life Technologies	12321D
H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium	Diagenode	C15410200-10
Chelex® 100 Resin	Bio-Rad	142-2832
Proteinase K	Life Technologies	17916
Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6	Millipore	05-724
LightCycler® 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001