Kromatin Immunoprecipitation analys för identifiering av Arabidopsis Protein-DNA-interaktioner<em> In Vivo</em

Summary

Kromatin immunoprecipitation är en kraftfull teknik för identifiering av DNA-bindande ställen för Arabidopsis-proteiner in vivo. Detta förfarande innefattar kromatin tvärbindning och fragmentering, immunoutfällning med selektiva antikroppar mot proteinet av intresse, och qPCR analys av bundet DNA. Vi beskriver en enkel ChIP-analys optimerad för Arabidopsis växter.

Abstract

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Introduction

Under senare år har ett brett utbud av genetiska, molekylära och genomiska verktyg har tagits fram i modellen arter Arabidopsis thaliana. Denna teknik har underlättat enormt framsteg när det gäller att förstå hur växtutveckling regleras. Bland de utvecklingsprocesser som studerats med hjälp av Arabidopsis som förebild, har genetisk kontroll av blomningstid i stor utsträckning analyserats. Dessa studier har visat att växter modulerar mycket exakt tid för blomning som svar på endogena signaler såsom hormoner och ålder av anläggningen, och även miljö signaler såsom fotoperiod och temperatur som synkroniserar blommande tid med det naturliga kretsloppet av säsongerna ^{1, 2.} Isoleringen och karakteriseringen av Arabidopsis-mutanter med förändringar i tiden för blomningen har determinanten i avtäckningen ett komplext nätverk av gener som reglerar blomningstid i beroende av endogena och miljöfaktorer. Dessa genetiska kretsar ärintegrerad i nivå med några mästare gener som fungerar som växlar av blommande och den exakta tidpunkten för blommor inledande beror på balansen mellan blommande främja och undertrycka aktiviteter som arbetar uppströms blomster Integrator generna ^1,3.

Den funktionella karakterisering av gener som identifierades för deras roll i kontrollen av blommande initiering, med hjälp av den senaste tidens användning av genomiska metoder, har avslöjat den centrala roll som transkriptionell reglering i moduleringen av blomningstid. Faktum är att många av befälhavaren gener av blommande kodar transkriptionsfaktörer ^4. Dessutom har ett antal kromatin remodeling proteinkomplex påverka uttrycket av mall gener av blomning. Ett antal av de mutanter Arabidopsis isolerade för deras förändrade blomningstid visade sig bära mutationer i gener som kodar för en mängd olika kromatin modifierings. Olika kromatin remodelers som introducerar posttranslationella modifieringar i Histone svansar, flytta nukleosomer i förhållande till DNA eller byta kanoniska histoner genom histon varianter nödvändiga för en korrekt reglering av blomning i Arabidopsis ^5,6. Några av dessa kromatin remodeling aktiviteter katalyserar avsättning eller borttagande av kovalenta modifieringar såsom acetylering eller metylering i specifika histon rester. Dessa histon märken specifikt känns igen av specialiserade effektenheter som rekryterar andra kromatin remodeling komplex, transkriptionsfaktorer eller komponenter i transkriptionsmaskineriet att reglera transkriptionsaktiviteten för blommande gener.

Kromatin Immunoprecipitation (chip) möjliggör identifiering av in vivo-DNA-bindningsställen för proteiner av intresse (fig 1). Detta förfarande drar fördel av förmågan hos vissa kemikalier för att tvärbinda proteiner till DNA. De resulterande DNA-protein-komplex kan sedan immunprecipiteras genom användning av specifika antikroppar against transkriptionsfaktorer, kromatin-bindande proteiner, eller vissa modifieringar och heterologa epitoper (vanligen kallat "taggar") bundna till proteinet av val. DNA renades från dessa immunoprecipitat kan användas som en mall i kvantitativa PCR (qPCR) reaktioner för att bedöma för anrikning av speciella sekvenser av intresse. På detta sätt, kan bindningsställena för transkriptionsfaktorer eller distributionen av histon märken i synnerhet gener fastställas ^7,8. Dessutom, i kombination med nästa generations sekvensering (NGS) som möjliggör massiva parallella sekvensering, har chiptekniken möjliggjort genomet hela identifiering av bindningsställen för transkriptionsfaktorer samt avtäckningen epigenomiska landskap histon modifieringar. Vidare samtidig analys av genuttryck medger övervakning hur bindningen av transkriptionsregulatorer eller deposition av särskilda histon märken korrelerar med den transkriptionella activity av gener ^9.

Användningen av ChIP protokoll i Arabidopsis har gjort en bedömning av inverkan som en variation av transkriptionsregulatorer har på kromatinet organisationen master gener av blomning och hur dessa strukturella förändringar påverkar genuttryck ^5,6. Tidigare resultat visade att Arabidopsis locus TIDIGT SÅLLNING I korta dagar (EBS) fungerar som en repressor av blommande och mutanter i denna gen visar en acceleration av blommande och uppreglering av befälhavaren genen av blommande FT. Dessutom förlust-of-funktion mutationer i FT trycka helt tidig blomning fenotypen av ebs muterade växter, vilket tyder på att FT krävs för tidigt blommande i EBS mutanter och att EBS är nödvändig för att undertryckandet av denna herre gen av blommande ^{10 11.} EBS kodar för en PHD-innehållande protein som specifikt kan binda histon H3 di- och trimethylated i the lysin 4 återstod (H3K4me2 / 3), vilket tyder på en roll för EBS i kromatin-medierad repression av FT ^12. Användningen av chipet tillvägagångssätt visade att Arabidopsis PHD-innehållande protein EBS ^10,11 binder regulatorregionerna enligt blom- integratorn genen FT att förtränga dess uttryck ^12. Ytterligare data som erhållits genom användning av chip-teknik visade att detta protein krävs för att bibehålla låga nivåer av histonacetylering, ett kännetecken för aktiv transkription, i kromatinet på denna mastergenen av blomning under initiala stegen av Arabidopsis utveckling. Dessa observationer, tillsammans med genetiska och genuttryck data visar att detta Arabidopsis PHD-innehållande protein har en central roll i finjustering av blomningstid genom att modulera uttrycket av blommor integrator genen FT ^12. Arbetet presenteras här ger en optimerad metod användbar inte bara för analysen av histoner utan även för andrakromatin associerade proteiner, och med ökad effektivitet och minskade experimentell tid. Dessutom visar rapporten hur användningen av chipprotokoll har gett nya insikter i förhållandet mellan förändringar i kromatin modifieringar och transkriptionstillstånd växtgener och hur dessa kromatin-medierade mekanismer av genuttryck kontroll inverkan på uppkomsten av blomning i Arabidopsis.

Protocol

1. Tvärbindning av växtmaterial (1 tim) Odla Arabidopsis linjer som används i experimentet (vildtyp – WT – kontra mutanter och / eller linjer som uttrycker den märkta versionen av proteinet av intresse kontra linjer som uttrycker taggen inte smält till något protein) under 12-18 dagar på stora petriskålar (150 mm) med MS-agarmedium (1 L: 1x Murashige & Skoog-salter, 10 g sackaros, 0,5 g MES, pH 5,7 (KOH), 1% agar). Alternativt, odla växter på krukor innehållande 3: 1 blandning av jord och vermi…

Representative Results

Åtta huvudstegen kan pekas ut i detta chip protokoll för identifiering av in vivo protein-DNA-interaktioner, inklusive odling och skörd av växtmaterial, tvärbindning av kromatin, kromatin isolering, kromatin fragmentering, selektiv isolering av komplexen mellan DNA och proteinet av intresse genom immunoutfällning, proteindigestion, DNA-rening, och qPCR analys (Figur 1). Ett mycket viktigt steg i spån protokollet är fixeringen av DNA-protein-interaktioner i en tvärbindningsreaktion. Typ…

Discussion

Chipet protokoll som beskrivits här är en reproducerbar och kraftfull teknik för att analysera växelverkningar mellan proteiner och specifika DNA-sekvenser in vivo i Arabidopsis växter. En framgångsrik identifiering av bindningsställen för proteiner av intresse kräver ett lämpligt urval av växtorgan eller utvecklingsstadier där relevanta interaktioner faktiskt äger rum. Dessutom är det viktigt att erhålla en lämplig fixering av växtmaterialet och en optimal skjuvning av kromatin genom sonikerin…

Materials

MES	Sigma	M8250
MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture)	Sigma	M5524
Formaldehyde 37%	Sigma	F8775-25	Use under the fume hood
Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack	Roche	5892791001
Bioruptor Standard sonication device	Diagenode	B01010002 (UCD200TO)
Glycine	Sigma	50046
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G	Life Technologies	10003D/10001D	Check manufacturer’s manual for antibody affinity
Miracloth	Merck Millipore	475855
Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution	Life Technologies	85112
(mouse, rat, rabbit…)-IgG	Diagenode	C15400001, C15420001, C15410206
Magnetic rack – DynaMag™-2	Life Technologies	12321D
H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium	Diagenode	C15410200-10
Chelex® 100 Resin	Bio-Rad	142-2832
Proteinase K	Life Technologies	17916
Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6	Millipore	05-724
LightCycler® 480 SYBR Green I Master	Roche	4707516001