עכברי Dermal פיברובלסטים בידוד על ידי FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
פיברובלסטים הם סוג תא העיקרון אחראי להפרשת מטריקס ומהווה מרכיב קריטי של איברים ורקמות רבים. פיזיולוגיה והפתולוגיה פיברובלסטים בבסיס ספקטרום של גופים קליניים, כולל fibroses באיברים רבים, הכוויות הבאות צלקות hypertrophic, אובדן תפקוד לב לאחר איסכמיה, והיווצרות של סרטן סטרומה. עם זאת, fibroblasts יישאר סוג גרוע מאופיין של תא, במידה רבה בשל ההטרוגניות הטבועה בם. שיטות קיימות לבידוד של fibroblasts דורשות זמן בתרבית תאים שעמוקים משפיע פנוטיפ תא והתנהגות. כתוצאה מכך, מחקרים רבים חוקרים ביולוגיה פיברובלסטים להסתמך על מניפולציה במבחנה ולא מדויק ללכוד פיברובלסטים התנהגות in vivo. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו פרוטוקול מבוסס FACS לבידוד של fibroblasts מעור הגב של עכברים בוגרים שאינו דורש תרבית תאים, וכך preserving תעתיק הפיזיולוגי ופרופיל proteomic של כל תא. האסטרטגיה שלנו מאפשרת להדרה של שושלות שאינן mesenchymal באמצעות שער שלילי שושלת (לין -) ולא אסטרטגית בחירה חיובית, כדי למנוע מראש את הבחירה או העשרה של תת-אוכלוסייה של fibroblasts להביע סמני משטח ספציפיים ולהיות כוללניים ככל האפשר ברחבי זה הטרוגנית סוג תא.
Introduction
Fibroblasts לעתים קרובות מוגדר כמורפולוגית תאים דמוי כישור שלדבוק מצעי פלסטיק. פיברובלסטים הם סוג תא העיקרון אחראי לסינתזה ושיפוץ מטריקס באיברים עובריים ומבוגרים 1. פיברובלסטים הם כך קריטיים להתפתחות יונקים ולתרום באופן משמעותי לסביבה תאית המשפיעה על ההתנהגות של שכנות סוגי תאים הנמצאים בכל רקמות ואיברים.
פיברובלסטים הם גם סוג התא העיקרי מאחורי קבוצה מגוונת של מצבים רפואיים הגורמים לניטל קליני עצום. פעילות פיברובלסטים פתולוגיים פוגעת בתפקוד רקמה נורמלי וכוללת רקמה והאיבר סיסטיק (כגון ריאות וכבד), הצטלקות הבאה ריפוי פצע עורית, טרשת עורקים, טרשת מערכתית, והיווצרות הפלאק טרשתי לאחר פציעת כלי דם 2-5. ריפוי פצעים בפרט, שתי בחריפות וכרונית, כרוך דeposition של רקמת צלקת שלא דומה לי ולא פונקציות כמו הרקמה הנורמלית המקיפות אותו, ומוביל לתחלואה משמעותית על פני מדינות פתולוגיים שונות. בעקבות פציעה, יש מעבר של fibroblasts לmyofibroblasts, אשר לאחר מכן להפריש מרכיבי ECM מבניים, להפעיל אפקטים אוטוקריני על סוגי תאים שכנים, ולהחזיר את היציבות מכאנית על ידי הפקדת רקמת צלקת 6.
ברקמות עורית קיימים שונות משמעותיות באיכות תיקון פצע על פני זמן התפתחותי ובין אתרים אנטומיים. בשני השלישים הראשונים של חיי העובר מרפא ללא צלקות; עם זאת, מהשליש השלישי ובכל רחבי בגרות, בני האדם לרפא עם צלקת. אתר ספציפי, בנוסף לגיל ספציפי, הבדלים בריפוי פצע קיימים. פצעים בחלל הפה לשפץ עם היווצרות צלקת מינימאלית 7,8, ואילו בתצהיר רקמת צלקת בתוך פצעי cutaneous הוא משמעותי 9. מחלוקת נמשכת גoncerning ההשפעה היחסית של הסביבה לעומת המאפיינים הפנימיים של fibroblasts המקומי בתוצאה של ריפוי פצע בלגבי שני גיל ומיקום 10,11. בהתחשב בהבדלים המשמעותיים בריפוי של עכבר אוראלי לעומת הדרמיס עורית ועוברי מוקדם יותר (E15) לעומת מאוחר יותר עוברי דרמיס (E18), סביר להניח כי הבדלים מהותיים באוכלוסיות של fibroblasts בגילים התפתחותיים מסוימים ובין אתרים אנטומיים שונים קיימים .
בשנת 1986, הרולד פ דבוז'ק הניח גידולים פצעים שלא מחלים 12. דבוז'ק הגיע למסקנה כי גידולים להתנהג כמו פצעים בגוף ולגרום לסטרומה על ידי הפעלת ריפוי פצע תגובה של המארח. מאז מחקרים רבים חקרו את התרומה של fibroblasts להתקדמות של קרצינומה של 13-15, אבל כמו במקרה של ריפוי פצע, הזהות ומקור עוברי של פיברובלסטים שתורמים לתא סטרומה של CA עוריתrcinomas לא הוגדר כראוי. התשובה לשאלה זו נושאת את הרלוונטיות רפואיות שניתן מחקרים האחרונים חושפים פיברובלסטים הקשורים גידול כמטרה פוטנציאלית יעילה לטיפול אנטי-סרטני 16.
זיהוי ולהבא בידוד שושלות פיברובלסטים ניחן בפוטנציאל fibrogenic in vivo הוא צעד חיוני לקראת יעילות המניפולציה תגובתם לפגיעה במגוון רחב של מצבי מחלה אקוטיים וכרוניים. בשינה 1987, קורמאק הפגין שתי תת-אוכלוסיות של fibroblasts, אחד המתגורר בתוך פפילרי ואחד בתוך הדרמיס רשתי 17,18. תת-אוכלוסייה שלישית נמצאה קשור לזקיקי שיער באזור papilla עורי של 19,20 הזקיק. כאשר בתרבית, הבדלי התערוכה תת פיברובלסטים אלה בפוטנציאל צמיחה, מורפולוגיה, וגורם / ציטוקינים צמיחת פרופילי 21-24.
עד כה, מחקרים שבחן פיברובלסטים הואterogeneity במידה רבה לא הצליח לאפיין כראוי גיוון התפתחותיים ותפקודי בקרב fibroblasts in vivo. זה, בחלקו, הוא תוצאה של הסתמכות על אוכלוסיות פיברובלסטים תרבותיים והשפעת homogenizing של תרבית תאים או בחירה חיובית על בסיס קולט משטח עצמי לא בא לידי ביטוי בכל fibroblasts 25. מחקר שנערך לאחרונה מהמעבדה שלנו הוכיח סמן משטח עמוק ושינוי תעתיק בfibroblasts חסר תרבות התרבותית לעומת מבודד על ידי המתודולוגיה הבידוד מבוסס FACS מוצגת בכתב היד הזה 26.
בהמשך לכך, זיהינו שושלת פיברובלסטים ספציפית בתוך הדרמיס הגב עכברי וקבענו כי שושלת זו, שהוגדרה על ידי ביטוי עוברי של Engrailed-1, היא אחראית בעיקר על תצהיר רקמות חיבור בעור הגב. פונקציות השושלת במהלך שני צורות אקוטיות וכרוניות של סיסטיק כוללים ריפוי פצע, היווצרות סטרומה סרטן, וקרינה מושרה סיסטיק 27. האפיון של שושלות שונות פיברובלסטים יש השלכות קריטיות עבור טיפולים שמטרת ויסות התנהגות fibrogenic.
במקום להשתמש בפרוטוקולים קיימים המסתמכים על מניפולציה במבחנה כדי להשיג תא בידוד 28,29, פרוטוקול הקציר (איור 1) המפורטים כאן יעזור לי ניתוחים אינפורמטיבי תשואה של fibroblasts שיותר מדויק ללכוד פנוטיפ והתנהגות in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה מציע אמצעי לבודד fibroblasts על ידי מיון מבוסס FACS, בהשוואה לשיטות קיימות, אשר גם לבחור עבור תת-אוכלוסייה או דורשים זמן בתרבית תאים לפני ניתוחים שלאחר מכן. הזמן הנדרש מקצירה של העור למיון של fibroblasts הוא כ 6 שעות; עם זאת, מספר העכברים המשמש בקציר יש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק מהמענק NIH R01 GM087609 (לHPL), מתנות מאינגריד Lai וביל שו לכבוד אנתוני שו (לHPL), HL099776 U01 מענק NIH (לMTL), המעבדה Hagey ל ילדים רפואת רגנרטיבית וקרן האלון (לMTL, GCG וHPL). GGW נתמכה על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד, תכנית הכשרת המדען הרפואי סטנפורד, וGM07365 מענק הכשרת NIGMS. ZNM נתמכה על ידי כירורגיה פלסטי קרן מחקר המלגה גרנט וקרן משפחת Hagey. MSH נתמכה על ידי מכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית (CIRM) מענק הכשרת עמית קליני TG2-01159, האגודה האמריקנית לניתוחים לסתות (Asms) / לסתות מנתחי קרן (MSF) מענק מחקר פרס, וההשתלות והנדסת רקמות מלגת פרס.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
References
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
- Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
- Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
- Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
- Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
- Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
- Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
- Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
- Cormack, D. H. . Ham’s Histology. , 450-474 (1987).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
- Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
- Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
- Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
- Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough – Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).
