Een eenvoudige methode voor Automated Solid Phase Extraction van watermonsters voor immunologische Analyse van Kleine verontreinigende stoffen
Summary
A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.
Abstract
Een nieuwe methode voor vastefase-extractie (SPE) milieu watermonsters voorgesteld. De ontwikkelde prototype is kostenefficiënt en gebruiksvriendelijk, en maakt het mogelijk om een snelle, geautomatiseerde en eenvoudige SPE voeren. De pre-geconcentreerde oplossing is geschikt voor analyse door immunoassay, met een laag gehalte organisch oplosmiddel. Een werkwijze wordt beschreven voor de extractie en pre-percentage natuurlijke hormoon 17β-oestradiol in 100 ml watermonsters. Omgekeerde fase SPE wordt uitgevoerd met octadecyl-silicagel sorptiemiddel en elutie uitgevoerd met 200 pl methanol 50% v / v. Eluent wordt verdund door toevoeging van di-water om de hoeveelheid methanol te verlagen. Na bereiding handmatig SPE kolom, wordt de totale procedure automatisch uitgevoerd binnen 1 uur. Aan het eind van het proces wordt oestradiol concentratie gemeten met behulp van een commercieel enzym-gekoppelde immuun-sorbent assay (ELISA). 100-voudig pre-concentratie wordt bereikt en het gehalte aan methanol in slechts 10% v / v. Vol terugvorderingen van het molecuulworden bereikt met 1 ng / l spiked gedeïoniseerd en synthetische zeewater monsters.
Introduction
Monstervoorbereiding is een belangrijke stap in een analytisch proces. Vooral het verwijderen van matrixeffecten, vermindering van storingen en de verrijking van het analyt nodig om nauwkeurige resultaten te bereiken en lage detectiegrenzen. Hormoonverstorende stoffen (EDC's) zijn van bijzonder belang vanwege hun actie op de levende organismen, zelfs wanneer aanwezig op zeer lage niveaus in het milieu. Het natuurlijke hormoon 17β-estradiol is aanwezig op de EU watervervuiling watch list en gevoelig te worden toegevoegd aan de lijst van prioritaire stoffen die vallen onder de Europese Kaderrichtlijn Water. Vaste fase-extractie (SPE) is gewoonlijk voor de analyse van kleine verontreinigingen in het water, zowel chemisch 1-5 (chromatografie, massaspectrometrie) en immunologische 6-9 detectiemethoden. De laatste kreeg belang op het gebied van toezicht op het milieu, zoals immunoassays zijn verkrijgbaar in grote verscheidenheid van formaten, zijn specifiek voor de tarGebruik analyt, en bereiken lage aantoonbaarheidsgrenzen. 6, 7, 10, 11 Diverse enzymgekoppelde immunosorbent assays (ELISA) zijn commercieel verkrijgbaar en in staat om meerdere monsters tegelijkertijd te analyseren op een multi-well plaat. De procedure bestaat uit achtereenvolgende reactiestappen die enkele uren kan duren. Het uiteindelijke reactieproduct kan optisch worden gedetecteerd om de concentratie van het doelwitmolecuul op basis van een ijkcurve te bepalen.
Klassieke SPE procedures omvatten sorbens pre-conditioning, monstername, wassen, elutie en indampen van het eluens. Het oplosmiddel gebruikt voor het verdunnen van het extract wordt gekozen afhankelijk van de detectiemethode. Voor immunologische werkwijzen, de hoeveelheid organisch oplosmiddel beïnvloedt sterk de gevoeligheid van de werkwijze. 12
Naast het herstel en de pre-concentratie uitvoeringen, de werkwijze moet ook eenvoudig en kostenefficiënt. Automatisering van de procedure helpt tot-mens-gerelateerde fouten te verminderen. In onze vorige werk 13 we ons prototype voor geautomatiseerde SPE geïntroduceerd, en onze methode werd toegepast op de analyse van het natuurlijke hormoon 17β-estradiol in zee watermonsters. Met de huidige video willen we de technische voordelen van onze methode vergeleken met de traditionele off-line en on-line SPE, en de bijzondere compatibiliteit met detectie door immuno-reacties te markeren. We beschrijven het protocol toegepast watermonsters voor de detectie van 17β-oestradiol. SPE wordt uitgevoerd met octadecyl-silicagel (C18) sorbent fase en elutie wordt uitgevoerd met verdunde methanol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een nieuwe werkwijze voor de bereiding van watermonsters gevolgd door analyse met behulp immunoassay voorgesteld. Het instrument maakt het mogelijk om de vaste fase extractie uit te voeren op een geautomatiseerde en gebruiksvriendelijke manier.
De filtratie van het watermonster vóór de injectie in het systeem kritisch. Eventuele deeltjes nog in de oplossing mogelijk verstopping van de vloeibare netwerk veroorzaken en belemmeren de kolom SPE. Een andere belangrijke stap is de bereiding van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.
Materials
| Filter membrane 0.2 μm pore size | Merck Millipore | GNWP04700 | For sample filtration |
| Nylon membrane 11 μm pore size | Merck Millipore | NY1104700 | For SPE column |
| Disposable biopsy punch 5 mm | Medical Budget | 39302439 | |
| Nucleodur C18 ec | Macherey Nagel | 713550.01 | 50 μm particle diameter |
| Synthetic sea water | Sigma Aldrich | SSWS500-500ML | |
| Methanol | VWR | ||
| 17beta-estradiol standard | Enzo Life Science | 300 ng/ml | |
| 17beta-estradiol ELISA kit | Enzo Life Science | ADI-900-008 | 96 wells, range 30 – 3000 ng/L |
References
- Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
- Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
- Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
- Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
- Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
- Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
- Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
- Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
- Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
- Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
- Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
- Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
- Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
- Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
- Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).
