בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב
Summary
This manuscript describes the creation of defined engineered cardiac tissues using surface marker expression and cell sorting. The defined tissues can then be used in a multi-tissue bioreactor to investigate mechanisms of cardiac cell therapy in order to provide a functional, yet controlled, model system of the human heart.
Abstract
Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that replicate the biofidelity of three-dimensional native human myocardium, while also enabling a controlled level of biological complexity, and allowing non-destructive longitudinal monitoring of tissue contractile function. Initially, human engineered cardiac tissues (hECT) were created using the entire cell population obtained from directed differentiation of human pluripotent stem cells, which typically yielded less than 50% cardiomyocytes. However, to create reliable predictive models of human myocardium, and to elucidate mechanisms of heterocellular interaction, it is essential to accurately control the biological composition in engineered tissues.
To address this limitation, we utilize live cell sorting for the cardiac surface marker SIRPα and the fibroblast marker CD90 to create tissues containing a 3:1 ratio of these cell types, respectively, that are then mixed together and added to a collagen-based matrix solution. Resulting hECTs are, thus, completely defined in both their cellular and extracellular matrix composition.
Here we describe the construction of defined hECTs as a model system to understand mechanisms of cell-cell interactions in cell therapies, using an example of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSC) that are currently being used in human clinical trials. The defined tissue composition is imperative to understand how the hMSCs may be interacting with the endogenous cardiac cell types to enhance tissue function. A bioreactor system is also described that simultaneously cultures six hECTs in parallel, permitting more efficient use of the cells after sorting.
Introduction
הנדסת רקמות לב התקדמה מאוד בעשור האחרון, עם מספר קבוצות פרסום תוצאות של רקמות מתפקדות במלואה, מכים עשו משני cardiomyocytes murine 1-6, ולאחרונה, גזע האנושי תא נגזרות myocytes לב 7-12. בתחום ההנדסה ברקמת הלב הוא מונע על ידי שתי מטרות עיקריות ובעצם עצמאי: 1) לפתח שתלי אקסוגניים כי ניתן להשתיל לתוך אי לבבות לשיפור תפקוד 4-6; ו -2) לפתח מודלים חוץ גופייה לחקר פיזיולוגיה ומחלות, או ככלי הקרנה לפיתוחים רפואיים 2,7.
תלת ממדי (3-D) תרבית תאי נחשב חיונית לפיתוח כלי איתור הדור הבא, כמו מטריקס 3-D משקף microenvironment לב טבעי יותר מאשר תרבית תאים בשכבה 2-D מסורתית; אכן כמה היבטים של ביולוגיה של תא שונים באופן מהותי בתרבויות 2-D לעומת 3-D 13,14 </sup>. בנוסף, רקמות לב מהונדסות בנויות ממרכיבים מוגדרים לחלוטין: מטריצה תאית, ואוכלוסיית תא. עבור רקמות לב אנושיות מסורתיות מהונדסות, בעוד רכב תאי מטריקס (בדרך כלל הפיברין 9 או קולגן 7,8,10) נשלט לחלוטין, רכב תא קלט מוגדר פחות טוב, עם התערובת כולה של תאים מתוך בידול לב מכוון של כל אחד תאי גזע עובריים (ESC 7,9) או תאי גזע מושרים (iPSC 10,12) להתווסף הרקמות. בהתאם לקו תאים ספציפיים ואת היעילות של פרוטוקול בידול בשימוש, אחוז cardiomyocytes וכתוצאה מכך יכול לנוע בין פחות מ -25% ליותר מ -90%, את הפנוטיפ cardiomyocyte מסוים (כלומר, ventricular-, atrial-, או קוצב דמוי) יכול גם להשתנות, אפילו שבריר הלא cardiomyocyte יכול להיות מאוד הטרוגנית 15,16 ולשנות את מידת הבשלות של מ 'לב הבדילyocytes 17.
עבודות הנדסיות ברקמת לב אחרונות ניסו לנהל את אוכלוסיית תאי הקלט, עם או משטח תא קו 8 או תאי גזע עוברי אנושי כתב לב סמני 18 בשימוש כדי לבודד את מרכיב myocyte לב של הבידול. בעוד שבתחילה רקמה מורכבת myocytes לב רק היה נראה האידיאל, זה למעשה לא המקרה; hECTs מורכבת רק מיוציטים מלב מצליחה לדחוס לתוך רקמות פונקציונליות, עם כמה קבוצות מציאת יחס 3: 1 של myocytes לב: פיברובלסטים הפקת כוח העווית הגבוה ביותר 8. באמצעות שיטות בחירת תאים שונות, כולל משטח סמנים למיון תא חי, אפשר ליצור hECTs עם אוכלוסיות תאים מוגדרות. בעוד סמנים של תאי סטרומה הלא לב היו זמינים במשך זמן מה, כגון סמן פיברובלסטים המשוערת CD90 19,20, סמני משטח של myocytes לב כבר יותר קשיםלזהות. SIRPα היה בין סמני משטח הלב הראשונים המזוהים לצורך מיוציטים מלב אנושי 18 ו הוכח להיות בררן במיוחד עבור שושלת הלב. לאחרונה, מצאנו כי פעמיים מיון SIRPα + ו- CD90 – תאים מניב כמעט cardiomyocytes טהור, עם CD90 + האוכלוסייה מפגין פנוטיפ פיברובלסטים דמויי (Josowitz, תצפיות לא פורסם). בהתבסס על ממצאים שנאספו אלה, בזאת אנו מתארים יצירת hECTs באמצעות 3: שילוב 1 של SIRPα + / CD90 – cardiomyocytes ו CD90 + פיברובלסטים.
היכולת להנדס ברקמת לב אנושית מוגדרת לחלוטין חיונית לא רק ליצירת כלי מיון חזקים, אלא גם לפיתוח מערכות מודל לחקור cell- המתעורר וטיפולי לב מבוסס גנים. בפרט, טיפולים בתאים רבים לאי ספיקת לב, ניצול סוגי תאים כולל תאי גזע mesenchymal (MSC) 21 </sup>, תאי גזע לב 22 ותאי mononuclear מח עצם 23-25, נבדקו במחקרים קליניים. בעוד רבים של התוצאות הראשוניות כבר מבטיחים 21,23,25, היתרון הראשוני לעתים קרובות פוחת לאורך זמן 26-29. מגמה דומה דווחה ברקמות לב מהונדסות בעכברים, אשר מציגות יתרון פונקציונלי משמעותי בשל תוספת MSC, אבל ההטבה לא שספגה במהלך לתרבות לטווח ארוך 1. בבסיס הביצועים תת אופטימלית הוא הידע המוגבל שלנו של המנגנונים השולטים טיפולים בתאים. הבנה עמוקה יותר של איך טיפולי תאים להשפיע לטובה שלהם, כמו גם תוצאות שליליות אפשריות של אינטראקציות myocyte-nonmyocyte, שתאפשר הפיתוח של טיפולים השתפרו מניב קליני הטבות משמעותיות וקבועות, עם תופעות לוואי מינימאליות, עבור חולים עם אי ספיקת לב.
כאן אנו מתארים את השימוש hECTs מוגדרת interrogאכול מנגנוני טיפול מבוסס תאים. רכב רקמות הנשלט חיוני לזהות גורמים ספציפיים להשפיע על ביצועי cardiomyocyte. ישירות השלים hECTs עם סוג התא הטיפולי של עניין (למשל, MSCs), יכול לחשוף את ההשפעה על ביצועי myocyte לב, כפי שהראנו חולדה ECTs 1.
הפרוטוקול רב השלבים הבאים מתחיל התמיינות תאי גזע לב הופנה, ואחריו ייצור של bioreactor הרב-הרקמה, וכלה בתיאור בניית רקמות אנליזה פונקציונלית. הניסויים שלנו מבוצעים באמצעות שורת NIH-אושרה H7 תאי גזע עובריים אנושיים (hESC). עם זאת, הפרוטוקולים הבאים גם נבדקו באמצעות קו hESC נוספים ושלושה תאי גזע מושרים (hiPSC) קווים עם תוצאות דומות. מצאנו כי יעילות בידול cardiomyocyte והצלחה ייצור hECT יכול להיות קו התא תלוי, במיוחד FOקווי r hiPSC נגזר מטופלים בודדים. על ידי ביצוע בפרוטוקול זה, שתי מנות 6-גם הם מצופים עם סך של 1.68 מיליון hESCs (140,000 תאים לכל היטב), בתשואה של כ -2.5 מיליון מיוציטים לאחר ההבחנה במשך 20 ימים ומיון, מספיק כדי להפוך שש רקמות מוגדרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בניית רקמות לב מהונדסת אנושיות תחמו (hECT) יכולה לספק מודל יותר עקבי ואמין של תפקוד myocyte לב אנושי. האנושות, כל הרכיבים הסלולר תאיים במערכת ידועים וניתן לטפל לפי צורך, ובכך להסיר את ההשפעה של בלבול סוגי תאים ידועים אחרים הנובעים תהליך ההתמיינות. כדי לאזן צמיחת תאים מהירה ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH (1F30HL118923-01A1) כדי TJC, HHSN268201000045C חוזה NIH / NHLBI PEN כדי KDC, המועצה מענק מחקר של הונג קונג TRS T13-706 / 11 (KDC), NIH (R01 HL113499) כדי Bdg, האמריקני איגוד הלב (12PRE12060254) כדי RJ, ומחקר גרנט מועצת HKSAR (TBRS, T13-706 / 11) כדי RL מימון נוסף שהועמדה TJC ידי NIH DRB 5T32GM008553-18 וכתוצאה התמחות על הדרכה NIDCR-הבינתחומי מערכות התפתחותית פגמי ביולוגית לידת T32HD075735. המחברים גם מבקשים להודות בתודה ארתור Autz ב"מרכז זאן של המכללה העירונית של ניו יורק על הסיוע עם עיבוד bioreactor ו ממדוח Eldaly לקבלת סיוע טכני. כמו כן, אנו מודים לד"ר קנת Boheler לקבלת ייעוץ על בידול הלב, וד"ר יהושע הייר למתן אדם בתאי גזע mesenchymal בנדיבות.
Materials
| Cell Culture | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich | A2411 | Prepare a 2.5 mg/ml stock in DMSO and filter-sterilize |
| B27 with Insulin | Life Technologies | 17505055 | |
| B27 without Insulin | Life Technologies | A1895601 | |
| CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | Create 6 μM stock, then aliquot and store at -20 °C. |
| Essential 8 Media | Life Technologies | A1517001 | |
| H7 Human Embryonic Stem Cells | WiCell | WA07 | |
| hESC Qualified Matrix, Corning Matrigel | Corning | 354277 | Thaw on ice at 4 °C overnight then aliquot 150 μl into separate tubes and store at -20 °C. |
| IWR-1 | Sigma-Aldrich | I0161 | Create 10 mM stock and aliquot. Store at -20 °C |
| Neonatal Calf Serum | Life Technologies | 16010159 | |
| Non-enzymatic Dissociation Reagent: Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | Keep refrigerated |
| Y-27632 (ROCK Inhibitor) | Stemgent | 04-0012 | Resuspend to a 10 mM stock concentration, aliquot and store at -20 °C. Avoid freeze thaw cycles. |
| Cell Sorting | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| CD90-FITC | BioLegend | 328107 | |
| Enzymatic Dissociation Reagent: Cell Detach Kit I (0.04 % Trypsin/ 0.03% EDTA, Trypsin neutralization solution and Hanks Buffered Salt Solution) | PromoCell | C-41200 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologics | S11250 | |
| SIRPα-PE/Cy7 | BioLegend | 323807 | |
| Tissue Construction | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin/0.1% EDTA | Fisher Scientific | 25-053-CI | Optional: For collection of supplemental cells of interest |
| 10x MEM | Sigma-Aldrich | M0275-100ML | |
| 10X PBS Packets | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Collagen, Bovine Type I | Life Technologies | A10644-01 | Keep on ice |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330057 | |
| Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM), High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Sodium HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | NC0536757 | |
| 15 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352096 | |
| 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning | 352235 | With integrated 35 μm cell strainer |
| 50 ml polyproylene centrifuge tube | Corning | 352070 | |
| 6-well flat bottom tissue-culture treated plate | Corning | 353046 | |
| Cell Scraper, Disposable | Biologix | 70-2180 | |
| Polysulfone | McMaster-Carr | ||
| Polytetrafluoroethylene (Teflon) | McMaster-Carr | ||
| Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting Microscope | Olympus | SZ-61 | Or similar, must have a mount for the high speed camera to attach |
| Electrical Pacing System | Astro-Med, Inc | Grass S88X Stimulator | |
| High Speed Camera | Pixelink | PL-B741U | Or similar, but must be capable of 100 frames per second for accurate data acquisition |
| Plate Temperature Control | Used to maintain media temperature during data acqusition. | ||
| Custom Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| LabView Post-tracking Program | available upon request from the authors |
References
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
- Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
- Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, 16-23 (2007).
- Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
- Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
- Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
- Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
- Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
- Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
- Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
- Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
- Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
- Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
- Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial–a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
- Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
- Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months’ follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
- Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
- Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010 (2014).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293 (2011).
- Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742 (2013).
- Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
- Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
- Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
- Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).
