생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.
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이 논문에서
요약
초록
생체 내 이미징은 자연스러운 맥락에서 세포 및 세포 내 구조의 동적 거동에 대한 전례 없는 액세스를 제공합니다. 포유류와 같은 고등 척추 동물에서 이러한 이미징 실험을 수행하려면 일반적으로 연구 중인 시스템에 대한 외과적 접근이 필요합니다. 배아 및 유충 제브라피쉬의 광학적 접근성은 이러한 침입 절차를 우회하고 온전한 유기체에서 이미징을 가능하게 합니다. 실제로, 제브라피시는 이제 증식에서 이동 및 분화에 이르는 광범위한 발달 맥락에서 생체 내 현미경을 사용하여 동적 세포 행동을 시각화할 수 있는 잘 정립된 모델입니다. 보다 최근의 발전은 미토콘드리아 이동 및 중심솜 역학을 포함한 세포 내 이벤트를 연구하기 위해 제브라피시의 사용이 증가하고 있다는 것입니다. 이러한 세포 내 구조를 형광 단백질로 유전적으로 표지할 수 있는 상대적 용이성과 이를 이미지화하기 위한 광학 현미경 기술의 사용은 제브라피시를 세포 생물학의 생체 내 모델로 변형시키고 있습니다. 여기에서는 소기관을 형광으로 표지하는 유전자 구조를 생성하는 방법을 설명하며, 구체적인 예로 미토콘드리아와 중심체를 강조합니다. 당사는 여러 구성에서 bipartite Gal4-UAS 시스템을 사용하여 특정 세포 유형에 대한 발현을 제한하고 일시적으로 발현되고 안정적인 형질전환 어류를 생성하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 마지막으로, 세포 내 역학을 이미징하는 데 가장 적합한 광학 현미경 검사 방법을 선택하기 위한 지침을 제공합니다.
서론
생체 내 이미징에서 가장 생리 학적 맥락에서 세포 행동의 직접 시각화를 제공합니다. 제브라 피쉬 배아, 자신의 신속하고 외부 개발 및 형광 라벨을 허용 유전 도구의 풍부한 배열의 투명성은 모든 주요 발달 이벤트의 역학을 규명하기 위해 생체 현미경의 사용 증가에 기여했다. 제브라 피쉬의 신경 시스템 개발의 이미징 연구는 예를 들어 크게 신경 전구 세포의 행동과 그 이후의 이동, 분화 및 회로 통합 1-8 포함한 자손의 운명에 대한 우리의 지식을 확장합니다.
스테이지는 이제 이러한 셀룰러 동작을 기초 세포 내 역학 조사를하도록 설정된다. 사실, 제브라 피쉬는 이미 생체 내 세포 생물학위한 도구로 악용되고있다. 골지 (15), 미토콘드리아 9-11을 시각화 할 수있게되었습니다 2,8,12-14 중심체, 미세 소관 (4)과 액틴 세포 골격 (16)은 17 엔도 좀과 생체 내에서 제브라 피쉬 배아에서 다른 세포 내 구조 중, 1,18 혀끝 멤브레인의 구성 요소가 복잡한. 지금까지 이러한 세포 소기관의 기능에 대해 알려진 내용의 대....
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프로토콜
모든 동물 실험은 위 바바리아 (독일 뮌헨)의 정부의 지역 규정에 따라 수행되었다.
1. 레이블 소기관 및 기타하는 세포 구조
참고 : 여기에 유전 기자는 찬란 태그 중심체, 미토콘드리아와 세포 막에 설명되어 구성한다.
- 형광 중심체와 미토콘드리아 레이블을 융합 단백질을 생성하기 위해 기존의 복제 방법 (29)를 사용합니다. 이러한 cetn4-YFP를 생성하는 노란색 형광 단백질과 같은 형광 단백질 2 (FP)과의 프레임 제브라 피쉬 centrin4 (cetn4)의 코딩 서열을 복제. 이러한 mitoCFP 9-11를 생성하는 시안 형광 단백질로 프레임 FP와 시토크롬 C 산화 효소의 서브 유닛 VIII의 미토콘드리아 타겟팅 순서를 복제.
- zebraf 특정 셀 (cetn4-YFP 또는 mitoCFP) 융합 단백질의 발현을 제한틱 배아 (예를 들어 신경 세포 나 근육 세포)는 양자 GAL4-UAS 발현 시스템 (26, 27)를 사용한다. 먼저 UAS 리포터 구조를 생성합니다. GAL4 결합 UAS 카세트의 하류 UAS 발현 벡터의 융....
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결과
여기에 넓은 필드와 이미지 미토콘드리아와 제브라 피쉬 배아 생활의 중심체에 공 초점 현미경의 사용을 직접 비교하고 대조된다. 피검 소기관 동성이있는 셀들의 위치 및 특정 세포 내 사건의 고유 주파수에 따라 일반적으로 넓은 필드 또는 공 초점 현미경 하나가 더 좋은 선택이다. 우리는 배아의 표면 상에 위치 RB 뉴런 깊은 위치 망막 세포 소기관을 묘화. 자신의 두 차원 형상과 함께 RB 신경 세포의 표면 위치는 넓은 필드와 공 초점 현미경 (그림 2) 모두에 의해 촬영되고 그들에게 좋은 후보를합니다. 공 초점 현미경을 사용하여 획득 이미지는하지만 상당히 느리다 특정 세포 내 이벤트 (미토콘드리아의 예를 들면, 운동, 그림 2C, D의 역학의 과소 평가로 이어질 수 ). 조직에 대량의 형광 신호는 초점면에 상세히 가.......
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토론
여기, 우리는 찬란 태그 미토콘드리아, 중심체와 제브라 피쉬 배아에서 생체 내에서 특정 세포 유형의 세포막에 GAL4-UAS 발현 시스템의 다양성을 보여줍니다. 다른 세포 내 소기관 또는 구조 라벨 많은 형광 융합 단백질은 공개 된 문헌에서 발견 될 수 있고, 각각의 실험실 상업적 소스 또는 비상업적 플라스미드 기탁 (예 Addgene)로부터 얻을 수있다. 새로운 형광 융합 단백질을 디자인하는 몇몇 파라미터 FP 사용되는 관심있는 단백질의 아미노 또는 카르복시 말단에 FP 융합 여부를 포함하여 고려 될 필요가있다. 형광 융합 단백질을 생성에 대한보다 철저한 설명은 독자가 주제 49-51에 대한 심층적 인 기사라고합니다.
우리는 UAS 기반의 유전자를 사용하여 융합 단백질의 공동 발현을 달성하기위한 세 가지 전략을 강조 표시합니다. 여러 해부E UAS 리포터 작 제물은 다른 기존 리포터 조합 있도록 추가적인 클로닝 필요없이 구.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
P.E.는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 및 Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS)의 지원을 받습니다. G.P.는 TUM-GS의 지원을 받았습니다. L.T.는 EMBO 펠로우십(EMBO ALTF 108-2013)의 지원을 받습니다. 제브라피쉬에 대한 D.P.의 연구는 Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration"(SFB 596)을 통해 DFG의 지원을 받았습니다. 통합 단백질 과학 센터(뮌헨) 및 유럽 공동체의 7차 프레임워크 프로그램(FP7/2007-2013)은 보조금 계약 번호 200611(MEMOSAD)에 따릅니다. 그는 현재 New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow이며 독일 과학 아카데미 Leopoldina의 펠로우십의 지원을 받았습니다. L.G.는 SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Project A11을 통해 DFG의 자금 지원을 받습니다.
우리의 어류 시설을 유지해 준 Kristina ....
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참고문헌
- Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
- Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Koster, R. W.
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