Tomodensitométrie et l'imagerie optique du couplage de l'ostéogenèse-angiogenèse à évaluer l'intégration des crâniens autogreffes et allogreffes
Summary
Implantation de greffons osseux autologues et allogéniques constituent accepté approches pour traiter importante perte osseuse cranio-facial. Pourtant, l'effet de la composition de greffe sur l'interaction entre la néovascularisation, la différenciation cellulaire et la formation osseuse est claire. Nous présentons un protocole d'imagerie multimodale visant à élucider l'interdépendance angiogenèse ostéogenèse à la proximité de la greffe.
Abstract
Un paramètre important qui détermine le succès d'une procédure de greffe osseuse est la vascularisation de la zone entourant la greffe. Nous émettons l'hypothèse que l'implantation d'une autogreffe osseuse induirait une plus grande régénération osseuse par abondante formation de vaisseaux sanguins. Pour étudier l'effet de la greffe sur la néovascularisation au site du défaut, nous avons développé une tomographie (μCT) approche micro-calculée pour caractériser nouvellement former des vaisseaux sanguins, ce qui implique la perfusion systémique de l'animal avec un agent de contraste de polymérisation. Cette méthode permet une analyse détaillée vasculaire d'un organe dans son intégralité. De plus, la perfusion sanguine a été évaluée en utilisant l'imagerie de fluorescence (FLI) d'un agent fluorescent par le sang. La formation osseuse a été quantifiée par FLI utilisant une sonde d'hydroxyapatite ciblée et analyse μCT. Recrutement de cellules souches a été suivie par l'imagerie par bioluminescence (BLI) de souris transgéniques qui expriment la luciférase sous le contrôle du promoteur de l'ostéocalcine.Ici nous décrire et démontrer la préparation de l'allogreffe, la chirurgie des défauts crânienne, les protocoles de numérisation μCT pour l'étude de la néovascularisation et l'analyse de la formation osseuse (y compris la perfusion in vivo de l'agent de contraste), et le protocole d'analyse des données.
La 3D analyse à haute résolution de la vascularisation démontré significativement plus angiogenèse chez les animaux avec des autogreffes implantés, en particulier en ce qui concerne la formation de l'artériole. En conséquence, la perfusion sanguine était significativement plus élevée dans le groupe d'autogreffe par la 7 ème jour après la chirurgie. Nous avons observé la minéralisation osseuse supérieure et une plus grande mesure la formation osseuse chez les animaux qui ont reçu des autogreffes. Autogreffe implantation résident induit le recrutement de cellules souches à la suture de la greffe osseuse-hôte, où les cellules différenciées en cellules osseuses formant entre le 7 e et 10 e jour postopératoire. Cette constatation signifie que le renforcement de la formation osseuse peut être attribuée àl'alimentation vasculaire augmentée qui caractérise autogreffe implantation. Les procédés décrits peuvent servir d'outil optimal pour étudier la régénération osseuse en termes de formation osseuse étroitement délimitée et la néovascularisation.
Introduction
Craniofaciale perte osseuse due à un traumatisme, résection de la tumeur, craniotomie de décompression, et malformation congénitale guérit rarement par elle-même et présente un besoin clinique non satisfait clair. Greffes osseuses autologues et allogéniques greffes osseuses sont largement utilisés pour traiter ces conditions 1.
Il est largement admis que l'ostéogenèse est étroitement couplé à l'angiogenèse 2,3. Ainsi, l'étude complète d'une thérapie proposée pour la régénération osseuse devrait inclure une enquête approfondie de l'arbre vasculaire de formation à travers le site du défaut entier. Il existe plusieurs méthodes disponibles pour caractériser la vascularisation dans les modèles de recherche. L'arbre vasculaire peut être étudiée par l'analyse histologique. Depuis l'histologie repose sur le tissu de sectionnement, il ya une forte probabilité que l'image résultante sera déformée. Pour résoudre ce problème, la microscopie intravitale peut être effectuée à des vaisseaux sanguins intacts d'image 4; toutefois, cette méthode estlimité à une formation d'image plan. μCT balayage d'échantillons obtenus à partir d'un animal perfusé avec un agent de contraste permet l'imagerie 3D du réseau vasculaire qui alimente le site de régénération 5. Cette approche permet une démonstration très détaillée de la vasculature un organe dans son ensemble, ainsi que d'une analyse minutieuse de la distribution des vaisseaux sanguins. En outre, μCT permet la différenciation entre les diamètres variés des vaisseaux sanguins, qui caractérisent les différents sous-types de vaisseaux sanguins.
Nous émettons l'hypothèse que l'implantation d'une autogreffe crânienne va induire une plus grande néovascularisation que l'implantation d'une allogreffe, et cette néovascularisation accrue entraînera, à son tour, à l'os amélioré formation.To poursuivre cette hypothèse, nous avons utilisé une variété de techniques. Nous avons étudié les modèles de l'arbre vasculaire nouvellement formé en effectuant une analyse comparative-μCT. Nous avons mesuré la perfusion sanguine en utilisant une sonde fluorescente sang-piscine. Ensuite, nous ânessed minéralisation du tissu osseux par FLI d'une sonde d'hydroxyapatite dirigée et l'analyse μCT. Enfin, nous avons suivi le recrutement de cellules souches et la différenciation, d'effectuer BLI chez des souris transgéniques dans lesquelles la luciférase est exprimée dans des cellules d'ostéocalcine positif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le but de l'approche de l'imagerie multimodales décrits ici est de permettre minutieux enquête de l'axe angiogenèse ostéogenèse dans le cadre de la greffe osseuse du crâne. Néovascularisation a été imagée en utilisant un protocole de μCT, ce qui a permis une haute résolution de démonstration 3D précise de l'arbre vasculaire alimentant l'ensemble du défaut crânien. μCT données peuvent être facilement analysés en utilisant des outils avancés tels que les logiciels IPL. Par exemple,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
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