טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה אופטית של צימוד Osteogenesis-אנגיוגנזה להערכת שילוב של Autografts עצם הגולגולת וAllografts
Summary
השרשה של שתלי עצם אוטולוגית ואלוגנאית מהווה קיבלה גישות לטיפול באובדן עצם craniofacial גדול. עם זאת, ההשפעה של הרכב שתל על יחסי הגומלין בין neovascularization, התמיינות תאים והיווצרות עצם לא ברורה. אנו מציגים פרוטוקול הדמיה multimodal נועד על מנת להבהיר את התלות ההדדית אנגיוגנזה-Osteogenesis בקרבת השתל.
Abstract
פרמטר עיקרי קביעת ההצלחה של הליך השתלת עצם הוא כלי דם באזור המקיף את השתל. חוקרים שערנו כי השתלה של autograft עצם יגרום התחדשות עצם גדולה יותר על ידי היווצרות כלי דם בשפע. כדי לחקור את ההשפעה של השתל על neovascularization באתר הפגם, שפיתחנו טומוגרפיה גישה מחושב מיקרו (μCT) לאפיין חדש יוצרים כלי דם, הכולל זלוף המערכתי של בעלי החיים עם חומר ניגוד polymerizing. שיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט של כלי דם איברים בשלמותו. בנוסף, זלוף הדם הוערך באמצעות הדמיה הקרינה (FLI) של סוכן ניאון שמקורן בדם. היווצרות עצם הייתה לכמת ידי FLI באמצעות בדיקה-ממוקד hydroxyapatite וניתוח μCT. גיוס תאי גזע היה פיקוח על ידי הדמיה פליטת אור (BLI) של עכברים הטרנסגניים המבטאות לוציפראז תחת השליטה של אמרגן osteocalcin.כאן אנו מתארים ומדגימים הכנת השתל, ניתוח פגם calvarial, פרוטוקולי סריקת μCT למחקר neovascularization וניתוח היווצרות עצם (כולל זלוף vivo של חומר ניגוד), והפרוטוקול לניתוח נתונים.
הניתוח ברזולוציה גבוהה 3D של כלי דם הפגין אנגיוגנזה הגדולה יותר באופן משמעותי בבעלי חיים עם autografts המושתל, במיוחד ביחס להיווצרות עורקיק. בהתאם לכך, זלוף הדם היה גבוה יותר משמעותי בקבוצת autograft מהיום ליום 7 בלאחר ניתוח. אנו נצפו מינרליזציה עצם מעולה ויצירת עצם גדולה יותר נמדדה בבעלי חיים שקיבלו autografts. השתלת autograft גיוס תאי גזע תושב מושרה לתפר עצם שתל-מארח, שבו התאים מובחנים לתאי יוצרי עצם בין ה -7 ל -10 היום לאחר ניתוח ה. ממצא זה אומר שיצירת עצם משופרת ניתן לייחס להאכלת כלי הדם המוגברת המאפיינת את השתלת autograft. השיטות מתוארות יכולות לשמש ככלי אופטימלי ללמוד התחדשות עצם במונחים של יצירת עצם מתוחמת בחוזקה וניאו-וסקולריזציה.
Introduction
איבוד עצם Craniofacial עקב טראומה, כריתת גידול, craniotomy decompressive, ופגם מולד נדיר מרפא בעצמו ומציג צורך קליני מסופק ברור. שתלי עצם אוטולוגית ושתלי עצם אלוגנאית נמצאים בשימוש נרחב לטיפול במצבים אלה 1.
זה מקובל שOsteogenesis מצמיד באופן הדוק עם אנגיוגנזה 2,3. כך, המחקר של טיפול מוצע להתחדשות עצם המלא צריך לכלול חקירה מקיפה של עץ כלי הדם ויוצר בכל אתר המום כולו. ישנן מספר שיטות זמינות כדי לאפיין כלי דם במודלי מחקר. עץ כלי הדם יכול להיחקר על ידי ניתוח היסטולוגית. מאז היסטולוגיה מסתמכת על חתך רקמה, קיים סבירות גבוהה שהתמונה המתקבלת תהיה מעוותת. כדי לטפל בבעיה זו, מיקרוסקופיה intravital יכולה להתבצע לכלי דם בשלמות תמונה 4; עם זאת, שיטה זו היאמוגבל להדמיה אחד-מטוס. סריקת μCT של דגימות שהתקבלו מבעלי חי perfused עם חומר ניגוד מאפשרת הדמיה 3D של רשת כלי דם המזינה את אתר ההתחדשות 5. גישה זו מאפשרת להפגנה מפורטת מאוד של כלי הדם של איבר בכללותו, כמו גם ניתוח קפדני של הפצת כלי דם. יתר על כן, μCT מאפשר בידול בין קטרים המגוונים של כלי דם, המאפיינים את תת-הסוגים השונים של כלי דם.
חוקרים שערנו כי השתלה של autograft calvarial יגרום neovascularization גדול יותר מהשתלה של שתל, וזה עלה neovascularization יוביל, בתורו, לעצם משופר formation.To להמשיך השערה זו אנו מועסקים במגוון טכניקות. חקרנו דפוסים של עץ כלי דם החדש שנוצר על ידי ביצוע ניתוח מבוסס μCT. מדדנו זלוף דם באמצעות בדיקה דם ניאון-בריכה. , אנו ישבנים הבאמינרליזציה רקמת עצם SED ידי FLI של בדיקה מכוונת hydroxyapatite וניתוח μCT. לבסוף, אנו פיקוח גיוס תאי גזע ובידול, ביצוע BLI בעכברים מהונדסים שבי לוציפראז מתבטא בתאי osteocalcin-חיובי.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה של גישות ההדמיה multimodal המתוארות כאן היא לאפשר חקירה מדוקדקת של ציר אנגיוגנזה-Osteogenesis בהקשר של השתלת עצם גולגולת. Neovascularization היה צילם באמצעות פרוטוקול μCT, שאיפשר הפגנת 3D ברזולוציה גבוהה מדויקת של עץ כלי הדם המזין את פגם גולגולת כולה. נתונים μCT ניתן לנתח בקלות באמצע…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
