Datortomografi och optisk avbildning av Osteogenesis-angiogenes koppling för att bedöma integration av skallbenet auto och Allografts
Summary
Implantation av autologa och allogena benimplantat utgör accepterade metoder för att behandla stora kraniofaciala benförlust. Ändå effekten av transplantat komposition på samspelet mellan kärlnybildning, celldifferentiering och benbildning är oklart. Vi presenterar en multimodal imaging protokoll syftar till att belysa angiogenes osteogenesis ömsesidigt beroende på transplantatet närhet.
Abstract
En stor parameter bestämma framgången för en ben ympning förfarande är vaskularisering av området kring implantatet. Vi antog att implantation av ett ben autograft skulle få större benåterbyggnad av yppig blodkärlsbildning. För att undersöka effekten av transplantatet på neovaskularisation på skadestället, har vi utvecklat en mikro datortomografi (μCT) tillvägagångssätt för att karakterisera nybildade blodkärl, vilket innebär systemisk perfusion av djuret med en polymeriserande kontrastmedel. Denna metod möjliggör detaljerad vaskulär analys av ett organ i sin helhet. Dessutom var blodperfusion bedömdes med användning fluorescensavbildning (FLI) av en blodburen fluorescerande medlet. Benbildning kvantifierades genom FLI användning av en hydroxiapatit-riktad sond och μCT analys. Stamcell rekrytering övervakades genom bioluminescens avbildning (BLI) av transgena möss som uttrycker luciferas under kontroll av den osteokalcin promotorn.Här beskriver vi och visar framställningen av allograft, calvarial defekt kirurgi, μCT skanningsprotokoll för kärlnybildning studien och benbildning analys (inklusive perfusion av kontrastmedlet in vivo), och protokollet för dataanalys.
Den högupplösta analys av kärl 3D uppvisade signifikant större angiogenes hos djur med implanterade auto, särskilt när det gäller arteriole bildning. Följaktligen blodperfusion var signifikant högre i gruppen med autologt bentransplantat från 7: e dagen efter operationen. Vi observerade överlägsen benmineralisering och mäts större benbildning hos djur som fick auto. Autograft implantering inducerad bosatta stamcells rekrytering till transplantat-värdbenet sutur, där cellerna differentieras till benbildande celler mellan den 7: e och 10: e postoperativa dagen. Detta konstaterande innebär att förbättrad formation ben kan tillskrivasden utökade kärl utfodring som präglar autograft implantation. De metoder som avbildas kan tjäna som ett optimalt verktyg för att studera benåterbyggnad i form av tätt avgränsas benbildning och kärlnybildning.
Introduction
Kraniofaciala benförlust på grund av trauma, tumörresektion, dekompressiv kraniotomi och medfödd defekt sällan läker av sig själv och presenterar ett tydligt ouppfyllt kliniskt behov. Autologa bentransplantat och allogena bentransplantat används i stor utsträckning för att behandla dessa tillstånd 1.
Det är allmänt accepterat att osteogenes är tätt kopplade med angiogenes 2,3. Sålunda bör den fullständiga studien om en föreslagen terapi för benåterbildning innefatta en omfattande undersökning av det vaskulära trädet bildar hela defekta stället. Det finns flera tillgängliga metoder för att karakterisera vaskularisering i forskningsmodeller. Kärl träd kan undersökas genom histologisk analys. Eftersom histologi beroende av snitt vävnad, det finns en hög sannolikhet för att den resulterande bilden kommer att snedvridas. För att lösa detta problem, kan intravital mikroskopi utföras bilden intakt blodkärl 4; emellertid är denna metodbegränsad till en-plan avbildning. μCT scanning av prover som erhållits från ett djur perfusion med kontrastmedel kan 3D-avbildning av vaskulära nätverk som matar regenere webbplats 5. Detta tillvägagångssätt gör att en mycket detaljerad demonstration av ett organ kärlsystem i sin helhet, liksom en noggrann analys av distributions blodkärl. Dessutom μCT möjliggör differentiering mellan olika diametrar blodkärl, som kännetecknar de olika subtyper av blodkärl.
Vi antog att implantation av en calvarial autograft inducerar större neovaskularisation än implantering av en allograft, och denna ökade neovaskularisation kommer att leda i sin tur till ökad ben formation.To driva denna hypotes använde vi en mängd olika tekniker. Vi undersökte mönster av det nybildade vaskulära trädet genom att utföra en μCT baserad analys. Vi mätte blodperfusion med hjälp av en blod pool fluorescerande sond. Nästa, vi åsnorSED benvävnaden mineralisering av FLI av en hydroxiapatit-riktad sond och μCT analys. Slutligen, övervakas vi stamcells rekrytering och differentiering, utför BLI i transgena möss där luciferas uttrycks i osteokalcin-positiva celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Syftet med de multimodala avbildning som beskrivs här är att möjliggöra noggrann undersökning av angiogenes-osteogenesis axel i samband med hjärn bentransplantation. Neovaskularisation avbildades med hjälp av en μCT protokoll, vilket möjliggjorde en exakt högupplösta 3D-demonstration av kärlträdet mata hela hjärn defekten. μCT data kan lätt analyseras med hjälp av avancerade verktyg såsom IPL programvara. Till exempel, tjockleken analys visas i figur 3C visade att de viktigaste skillna…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
References
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
