Post Column Derivatisering Bruke Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns

Summary

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Abstract

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Introduction

Høy ytelse væskekromatografi (HPLC) kombinert med innlegget kolonne derivatisering (PCD) er et kraftig verktøy som er nyttig i å løse en rekke problemer i analyselaboratoriet. Den kan brukes for å påvise forbindelser som er ellers umulig å oppdage med suite av detektorer er tilgjengelige ^1,2, øker signal av målanalytten, som tillater nedre grense for påvisning og kvantifisering ^3-5 eller selektivt å derivatisere en målanalytt for å unngå matrix effekter ^6. Vanlig anvendte PCD reaksjoner omfatter omsetningen av aminer, slik som aminosyrer, med orto-phthaladehyde ^7-9, ninhydrin- ^9,10 eller fluorescamin ^11,12, derivatiseringen av reaktive oksygenarter (ROS) med 2,2-difenyl- 1-picrylhydrazil radikal (DPPH ^{•) 13,14} eller 2,2'-azino-bis (3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre (ABTS) ^15,16, og bruk av den jodid-azidet reagens for å derivatisere svovel containing forbindelser ^17,18.

Det finnes imidlertid en rekke ulemper til bruk av PCD reaksjoner med HPLC-system ^6. Prinsipielt Blant disse er bruk av reaksjonsspoler mellom punktet for tilsetning av derivatiseringen reagens (er) og detektoren, som tillater tid for blanding og at reaksjonen skal opptre ^8. Disse reaksjonssløyfer ofte ha volumer av 500 ul eller mer, noe som er signifikant sammenlignet med volumet av resten av HPLC-systemet ^19. Bruken av disse høyt volum reaksjonssløyfer resulterer i øket topputvidelse sammenlignet med hva som ville bli observert uten tilstedeværelse av reaksjonssløyfen. Dette resulterer i kortere, bredere topper som har høyere grenser for kvantifisering og deteksjon og negativt påvirker kromatografisk oppløsning. Figur 1 og 2 fremheve forringelse av topp form som følge av tillegg av ulike innlegg kolonne reaksjon sløyfevolumer. denne analysenble utført med en mobilfaseblanding av 94% metanol og 6% Milli-Q-vann. Strømningshastigheten av den mobile fase var 1 ml / min, injeksjonsvolumet var 20 ul og analysen bølgelengden var 265 nm. Sløyfer av varierende dødvolumer fra 20 ul til 1 000 ul ble satt inn mellom søylen og detektoren for å simulere effektene av reaksjonssløyfe dødvolum i PCD metoder. Disse løkkene ble fremstilt fra rør av rustfritt stål med 0,5 mm indre diameter. Forsøket ble utført på et HPLC-system bestående av en styreenhet (SCL-10AVP), en lav trykkgradient ventil (FCL-10ALVP), en pumpe (LC-20AD), en injektor (SIL-10ADVP), og en PDA detektor ( SPD-M10ADVP). Den mobile fase ble pumpet gjennom en avgasser før innføring i HPLC-systemet. Separasjonen ble utført ved anvendelse av en 250 mm x 4,6 mm id 5 um-kolonne. Forsøksbetingelser ble valgt til å være typisk for PCD reaksjoner som nylig har blitt publisert i litteraturen.

Deenkleste, er mest vanlig post kolonnereaktoren oppsett betegnet som et ikke-segmentert rør-reaktoren som er effektivt en lang, tynn slange hvorigjennom væsken kan strømme, og reaksjonen kan finne sted. I dette systemet topputvidelse er avhengig ikke bare dødvolumet tilsettes til systemet, men også den innvendige diameter av røret som fremhevet av Iijimas et al. ^8. Videre spiller spiral geometri en del i den observerte merkevare utvidelse. Stewart ²⁰ uttalt at kveiling av reaktoren endrer den sekundære strømningsprofiler, noe som resulterer i bedre blanding, noe som betyr at de døde volumet kan bli minimalisert. Det har blitt sagt at peak utvidelse ikke er vesentlig når du bruker en åpen rundstrikkede spole ^21. Når toppen utvidelsen er overdrevent stor, kan andre typer av reaktorer også vurderes ^20,22. Disse kan omfatte sjiktreaktorer eller segmenterte strømningsreaktorer. Disse reaktorene er spesielt nyttige for sakte reaksjoner som ellers ville require stor reaksjon looper. Som ikke-segmenterte rørformede reaktorer er de vanligste typer reaktorer som brukes i PCD programmer, resten av denne artikkelen omhandler denne type reaktor oppsett.

Utformingen av reaksjonsstrømmen (RF) kolonne omfatter en multi-port endebeslag som gjør det mulig for mobilfase for å avslutte (eller enter) kolonnen gjennom enten en enkelt port lokalisert ved den radielle midtområdet av kolonnen eller tre åpninger som ligger ved den ytre veggområdet av kolonnen (se figur 3). Disse to strømmer er adskilt ved hjelp av et endefeste inneholdende en sentral porøs fritte som er omgitt av en ugjennomtrengelig ring som i sin tur er omgitt av en ytre porøs fritte som strekker seg ut til kolonneveggen. På grunn av den sentrale ugjennomtrengelige ring cross flow ikke er mulig mellom de to porøse områder.

Under reaksjonen strømnings kromatografi, blir derivatiseringen reagensen (e) pumpes mot retningen av mobil fasestrøm inn i en eller two av de ytre portene i reaksjonsstrømnings kolonnen. kolonne elueringsmiddel det blandes med derivatiseringen reagens (er) i den ytre fritte og føres til detektoren gjennom en fri ytre port. Reaksjonen strømningen kan brukes til enten et enkelt reagens derivatisering (en port for derivatisering reagens, til en port passere kolonnen elueringsmiddel til detektoren, og en port blokkert) eller et dobbelt-reagens-system (2 porter for derivatiseringen reagenser og en port for å passere kolonnen elueringsmiddel til detektoren). Strømningen fra den sentrale strømmen kan enten brukes til å detektere underivatized kolonne elueringsmiddel, effektivt multipleksing deteksjon ^23, eller føres til avfall.

En stor tuning teknikk som er tilgjengelig når det kjøres RF-PCD-kromatografi er forholdet mellom de sentrale og perifere strømmer. Det optimale forhold for hvert derivatisering avhenger av en rekke faktorer, for eksempel om den sentrale strømnings vil bli oppdaget eller føres til avfall. Derfor når det optimale forholdet er fastsatt, Bør det sørges for at den riktige strømningsforhold blir oppnådd før hvert forsøk blir utført.

Det er funnet at anvendelse av en fritte for å blande kolonne elueringsmiddel strømmen og derivatisering reagens i RF-PCD resulterer i mer effektiv blanding sammenlignet med tradisjonell blandeteknikker som vanligvis benytter en null dødvolum T-stykke eller lavt dødvolum W- stykke å blande de to bekker. Dette har tillatt for bruk av relativt små reaksjons løkker, eller til og med eliminering av reaksjonssløyfen helt. Reduksjonen av reaksjons sløyfe størrelse resulterer i skarpere topper sammenlignet med tradisjonelle post kolonne derivatiseringsreaksjoner metoder. Dette betyr at til tross for det faktum at ikke alle av kolonnen elueringsmiddel det er derivatisert, er bedre signal til støyforhold observert og derfor nedre grense for påvisning og kvantifisering kan oppnås.

Reaksjon flyt kromatografi er utviklet for å overvinne vanskelighetene med tilpasning av PCD reaksjons til moderne HPLC-kolonner og systemer, spesielt tap i effektivitet som følge av bandet utvide på grunn av store etterkolonne døde volumer som følge av behovet for å ansette stort volum reaksjon looper. De mer effektive blandeprosesser i RF-PCD sammenlignet med konvensjonelle PCD bety at mindre reaksjonsvolumer løkke kan anvendes som fører til en økning i observert separasjonseffektivitet. Videre RF-PCD kromatografi viser både økt signal og redusert støy i forhold til konvensjonelle PCD teknikker som resulterer i nedre grense for deteksjon og kvantifisering sammenlignet med konvensjonelle PCD metoder. En ytterligere fordel med RF-PCD sammenlignet med konvensjonelle PCD metoder er evnen til å overvåke underivatized strømmen som eluerer fra den sentrale porten på RF-kolonnen, så vel som den derivatiserte strømmen som eluerer fra det perifere området av kolonnen. RF-PCD er en relativt ny, men lovende teknikk som viser mange fordeler fremfor tradisjonelle PCD metoder.

<p class="jove_content"> Tilkobling av RF-kolonne oppnås i nesten samme måte som en konvensjonell HPLC-kolonne med den store forskjellen er antall endebeslag på en RF-kolonne. Anordninger som brukes for å koble til en standard HPLC kolonne for å HPLC-systemet er i stand til å bli brukt til å koble en RF-kolonne for å HPLC-systemet.

Protocol

Forsiktig: Se sikkerhetsdatablad (HMS) for alle materialer og reagenser før bruk (dvs. datablad for metanol). Sørg for bruk av alle nødvendige sikkerhetsrutiner ved håndtering av løsemidler og High Performance Liquid Chromatography (HPLC) elueringsmiddel. Sørg for riktig bruk av tekniske kontroller av HPLC, analytisk balanse og detektor instrumentering, og sikre bruk av personlig verneutstyr (vernebriller, hansker, frakk, full lengde bukser og lukket-toe sko). Merk: Denne protokollen beskriver 3 metoder for reaksjon f…

Representative Results

Den første PCD metode som ble tilpasset for bruk av RF-PCD var den derivatisering av antioksidanter ved hjelp av 2,2-difenyl-1-picrylhydrazil radikal (DPPH •) 24. Denne reaksjonen ble introdusert av Koleva et al., 25 og har vært mye brukt siden. Påvisnings avhengig av avfarging av DPPH • radikal, i nærvær av reaktive oksygenforbindelser, derav nærvær av antioksidanter resulterer i et fall i den observerte absorbans. Den DPPH • Reaksjons ofte an…

Discussion

RF-PCD gir mulighet for effektiv blanding av derivatiseringen reagens med HPLC avløpet post-kolonne uten bruk av reaksjonsspoler, minimere effekten av båndet bredere og bedre ytelse ved separering. RF-PCD fremgangsmåter har også vist forbedringer i signalrespons med hensyn til påvisningsmetoden. Camenzuli et al. ²⁸ var den første til å rapportere bruken av reaksjonen strømnings kolonner med DPPH ^• for deteksjon av ROS i en espresso prøve. Deres studie involverte analyse og optim…

Materials

HPLC instrument	Agilent	1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatisation system	Shimadzu	LC-20A
RF colum			Non-commercial
PEEK tubing	Sigma Aldrich	Z227307
Column stoppers			Provided with column
PEEK tube cutter	Sigma Aldrich	Z290882
Analytical Scale Balance			4-point analytical balance
Stop watch			Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials			Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials
HPLC Vials			Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)	Sigma Aldrich	Z232211
General Laboratory glassware			Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method
Methanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	17836
Ammonia	Sigma Aldrich	320145	Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4-aminoantipyrene	Acros Organics BVBA	AC103151000
Potassium ferricyanide	AnalaR	B10204-30