पोस्ट स्तंभ derivatization रिएक्शन प्रवाह उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी स्तंभों का उपयोग
Summary
A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.
Abstract
A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.
Introduction
उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) पोस्ट स्तंभ derivatization (PCD) के साथ मिलकर है कि विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला में अनेक मुद्दों को हल करने में उपयोगी है एक शक्तिशाली उपकरण है। यह यौगिकों कि अन्यथा उपलब्ध 1,2 डिटेक्टरों के सूट के साथ undetectable हैं का पता लगाने के लक्ष्य analyte है, जो या चुनिंदा का पता लगाने और quantitation 3-5 के निचले सीमा की अनुमति देता है के संकेत बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता आदेश से बचने के लिए एक लक्ष्य analyte derivatize मैट्रिक्स प्रभाव 6। आमतौर पर इस्तेमाल किया PCD प्रतिक्रियाओं ऐसे एमिनो एसिड के रूप में amines, की प्रतिक्रिया, ऑर्थो-phthaladehyde 7-9 से, 9,10 या fluorescamine 11,12, (आरओएस) प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की derivatization 2,2-diphenyl- साथ ninhydrin शामिल 1-picrylhydrazil कट्टरपंथी (DPPH •) 13,14 या 2,2'-azino-बीआईएस (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic एसिड (ABTS) 15,16, और आयोडाइड-azide अभिकर्मक के उपयोग derivatize के लिए सल्फर गontaining यौगिकों 17,18।
वहाँ रहे हैं, तथापि, एचपीएलसी सिस्टम 6 के साथ PCD प्रतिक्रियाओं का उपयोग करने के लिए कई कमियां। इनमें मुख्यतः derivatization अभिकर्मक (एस) और डिटेक्टर, जो मिश्रण और प्रतिक्रिया 8 घटित करने के लिए समय की अनुमति के अलावा के बिंदु के बीच प्रतिक्रिया कॉयल का इस्तेमाल होता है। ये प्रतिक्रिया अक्सर 500 μl या उससे अधिक है, जो एचपीएलसी प्रणाली 19 में से बाकी की मात्रा की तुलना में महत्वपूर्ण है की मात्रा है छोरों। इन उच्च मात्रा प्रतिक्रिया का उपयोग क्या प्रतिक्रिया पाश की उपस्थिति के बिना मनाया जाएगा की तुलना में वृद्धि हुई छोरों शिखर को विस्तृत बनाने में परिणाम है। यह छोटा, व्यापक चोटियों quantitation और पता लगाने की उच्च सीमा है कि में यह परिणाम है और नकारात्मक chromatographic संकल्प प्रभाव। 1 आंकड़े और 2 शिखर आकार कि विभिन्न पद स्तंभ प्रतिक्रिया पाश की मात्रा के अलावा से परिणाम की गिरावट पर प्रकाश डाला। इस विश्लेषण94% मेथनॉल के एक मोबाइल चरण रचना और 6% मिल्ली क्यू पानी के साथ प्रदर्शन किया गया था। मोबाइल चरण के प्रवाह की दर 1 मिलीग्राम / मिनट था, इंजेक्शन की मात्रा 20 μl था और विश्लेषण तरंग दैर्ध्य 265 एनएम था। 20 से 1000 μl μl से मृत की मात्रा बदलती के Coils स्तंभ और डिटेक्टर PCD तरीकों में प्रतिक्रिया पाश मृत मात्रा के प्रभाव का अनुकरण करने के लिए के बीच में डाला गया था। इन छोरों 0.5 मिमी आंतरिक व्यास के स्टेनलेस स्टील टयूबिंग से तैयार थे। प्रयोग एक एचपीएलसी एक नियंत्रक (एससीएल-10AVP) से मिलकर व्यवस्था पर प्रदर्शन किया गया था, एक कम दबाव ढाल वाल्व (एफसीएल-10ALVP), एक पंप (नियंत्रण रेखा-20AD), एक इंजेक्टर (एसआईएल-10ADVP), और एक पीडीए डिटेक्टर ( एसपीडी M10ADVP)। मोबाइल चरण एचपीएलसी प्रणाली में शुरूआत से पहले एक degasser के माध्यम से लगाया गया था। जुदाई एक 250 मिमी x 4.6 मिमी आईडी 5 माइक्रोन स्तंभ का उपयोग किया गया था। प्रयोगात्मक शर्तों PCD प्रतिक्रियाओं है कि हाल ही में साहित्य में प्रकाशित किया गया के विशिष्ट होने के लिए चुना गया था।
सरल, सबसे आम पद स्तंभ रिएक्टर सेटअप एक गैर-खंडों ट्यूबलर रिएक्टर जो प्रभावी रूप से एक लंबी, पतली ट्यूब के माध्यम से जो तरल प्रवाह कर सकते हैं और प्रतिक्रिया जगह नहीं ले सकता है करार दिया है। इस प्रणाली के शिखर में विस्तार न सिर्फ मृत मात्रा व्यवस्था करने के लिए कहा, लेकिन यह भी ट्यूब के रूप में Iijima एट अल। 8 से प्रकाश डाला के आंतरिक व्यास पर निर्भर है। इसके अलावा, कुंडल ज्यामिति मनाया ब्रांड का विस्तार करने में एक भूमिका निभाता है। स्टीवर्ट ने कहा कि 20 रिएक्टर की coiling बदलता माध्यमिक प्रवाह प्रोफाइल, बेहतर मिश्रण में जिसके परिणामस्वरूप, जिसका अर्थ है कि मृत मात्रा को कम किया जा सकता है। यह कहा गया है कि शिखर विस्तार महत्वपूर्ण है जब 21 का तार बुना हुआ एक खुला ट्यूबलर का उपयोग नहीं कर रहा है। जब पीक विस्तार जरूरत से ज्यादा बड़ी है, रिएक्टरों के अन्य प्रकार के भी 20,22 माना जा सकता है। ये बिस्तर रिएक्टरों या खंडों प्रवाह रिएक्टरों शामिल हो सकते हैं। इन रिएक्टरों धीमी प्रतिक्रिया है कि अन्यथा requir होगा के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैंई बड़ी प्रतिक्रिया छोरों। के रूप में गैर-खंडों ट्यूबलर रिएक्टरों PCD अनुप्रयोगों में इस्तेमाल किया रिएक्टरों का सबसे आम प्रकार, रिएक्टर की स्थापना के इस प्रकार के साथ यह लेख सौदों के बाकी हैं।
प्रतिक्रिया प्रवाह (आरएफ) स्तंभ के डिजाइन एक बहु बंदरगाह अंत संयोग ही है कि मोबाइल चरण या तो एक या स्तंभ के रेडियल मध्य क्षेत्र बाहरी पर स्थित तीन बंदरगाहों पर स्थित बंदरगाह के माध्यम से बाहर निकलने के लिए (या प्रवेश) स्तंभ की अनुमति देता है शामिल स्तंभ की दीवार क्षेत्र (चित्रा 3 देखें)। इन दो धाराओं का अंत एक केंद्रीय झरझरा मिलाना कि एक अभेद्य अंगूठी एक बाहरी झरझरा मिलाना है कि स्तंभ दीवार से बाहर फैली से घिरा बारी में है कि से घिरा हुआ है जिसमें फिटिंग का उपयोग कर अलग हो रहे हैं। केंद्रीय अभेद्य अंगूठी पार प्रवाह के कारण दो झरझरा क्षेत्रों के बीच संभव नहीं है।
प्रतिक्रिया प्रवाह क्रोमैटोग्राफी के दौरान, derivatization अभिकर्मक (एस) एक या tw में मोबाइल चरण प्रवाह की दिशा के खिलाफ पंप हैंप्रतिक्रिया प्रवाह स्तंभ की बाहरी बंदरगाहों में से ओ। स्तंभ eluent एक नि: शुल्क बाहरी बंदरगाह के माध्यम से बाहरी मिलाना में derivatization अभिकर्मक (एस) के साथ मिलाया जाता है और डिटेक्टर को पारित कर दिया है। रिएक्शन प्रवाह या तो एक एकल अभिकर्मक derivatization के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या एक दोहरी अभिकर्मक प्रणाली (derivatization अभिकर्मकों के लिए 2 बंदरगाहों और 1 के लिए बंदरगाह (derivatization अभिकर्मक के लिए 1 बंदरगाह, 1 बंदरगाह डिटेक्टर और 1 बंदरगाह अवरुद्ध करने के लिए स्तंभ eluent पारित करने के लिए) डिटेक्टर के लिए स्तंभ eluent) से गुजरती हैं। केंद्रीय धारा से प्रवाह या तो underivatized स्तंभ eluent, प्रभावी ढंग से बहुसंकेतन का पता लगाने के 23, या बर्बाद करने के लिए पारित पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
एक प्रमुख ट्यूनिंग तकनीक उपलब्ध है कि जब चल आरएफ PCD क्रोमैटोग्राफी मध्य और परिधीय प्रवाह का अनुपात है। प्रत्येक derivatization के लिए इष्टतम अनुपात में इस तरह के केंद्रीय प्रवाह या पता लगाया जाएगा कि क्या बर्बाद करने के लिए पारित जैसे कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है। इसलिए एक बार इष्टतम अनुपात निर्धारित किया गया हैयह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि सही प्रवाह अनुपात प्रत्येक रन प्रदर्शन किया जा रहा से पहले हासिल की है।
यह पाया गया है कि एक मिलाना के उपयोग स्तंभ eluent धारा और पारंपरिक मिश्रण तकनीक है कि आम तौर पर एक शून्य मृत मात्रा टी-पीस या कम मृत मात्रा को रोजगार के साथ तुलना में अधिक कुशल मिश्रण में आरएफ PCD परिणामों में derivatization अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए डब्ल्यू टुकड़ा दो धाराओं मिश्रण करने के लिए। इस अपेक्षाकृत छोटे प्रतिक्रिया छोरों के उपयोग के लिए अनुमति दी है, या पूरी तरह प्रतिक्रिया पाश का भी उन्मूलन किया है। तेज चोटियों में प्रतिक्रिया पाश आकार परिणामों की कमी पारंपरिक पोस्ट स्तंभ derivatization तरीकों की तुलना में। इसका मतलब यह है कि तथ्य यह है कि स्तंभ eluent के सभी नहीं derivatized है के बावजूद, शोर अनुपात करने के लिए अधिक से अधिक संकेत मनाया जाता है और पता लगाने और quantitation की इसलिए निचली सीमाएं प्राप्त किया जा सकता है।
रिएक्शन प्रवाह क्रोमैटोग्राफी PCD प्रतिक्रिया के रूपांतरण के साथ कठिनाइयों को दूर करने के लिए विकसित किया गया हैआधुनिक एचपीएलसी स्तंभों और प्रणालियों, बैंड को विस्तृत बनाने की वजह से दक्षता में विशेष रूप से हानि बड़े पद स्तंभ मृत बड़ी मात्रा में प्रतिक्रिया छोरों को रोजगार के लिए जरूरत की वजह मात्रा के कारण के लिए है। आरएफ PCD में और अधिक कुशल मिश्रण प्रक्रियाओं पारंपरिक PCD की तुलना में इसका मतलब यह है कि छोटे प्रतिक्रिया पाश मात्रा में मनाया जुदाई दक्षता में वृद्धि करने के लिए अग्रणी नियोजित किया जा सकता है। इसके अलावा आरएफ PCD क्रोमैटोग्राफी दोनों संकेत वृद्धि हुई है और पारंपरिक तरीकों की तुलना में PCD का पता लगाने और quantitation के निचले सीमा में जिसके परिणामस्वरूप पारंपरिक PCD तकनीकों की तुलना में कमी आई शोर से पता चलता है। पारंपरिक तरीकों की तुलना में PCD आरएफ PCD का एक अतिरिक्त लाभ underivatized धारा है कि आरएफ स्तंभ के केंद्रीय बंदरगाह के रूप में अच्छी तरह से derivatized धारा उस स्तंभ के परिधीय क्षेत्र से elutes से elutes निगरानी करने की क्षमता है। आरएफ PCD एक अपेक्षाकृत नया है लेकिन होनहार तकनीक है कि पारंपरिक PCD तरीकों पर कई फायदे को प्रदर्शित करता है।
<p class="jove_content"> आरएफ स्तंभ के कनेक्शन प्रमुख अंतर एक आरएफ स्तंभ पर अंत फिटिंग की संख्या होने के साथ एक पारंपरिक एचपीएलसी स्तंभ के रूप में लगभग एक ही तरीके से हासिल की है। एचपीएलसी प्रणाली के लिए एक मानक एचपीएलसी स्तंभ कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया फिटिंग एचपीएलसी प्रणाली के लिए एक आरएफ स्तंभ कनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने में सक्षम हैं।Protocol
Representative Results
Discussion
आरएफ PCD बैंड विस्तार के प्रभाव को कम करने और जुदाई के प्रदर्शन में सुधार प्रतिक्रिया कॉयल के उपयोग के बिना एचपीएलसी प्रवाह के बाद स्तंभ के साथ derivatization अभिकर्मक के कुशल मिश्रण के लिए अनुमति देता है। आरएफ PCD …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
Materials
| HPLC instrument | Agilent | 1290 Series HPLC | |
| Additional Pump(s) for derivatisation system | Shimadzu | LC-20A | |
| RF colum | Non-commercial | ||
| PEEK tubing | Sigma Aldrich | Z227307 | |
| Column stoppers | Provided with column | ||
| PEEK tube cutter | Sigma Aldrich | Z290882 | |
| Analytical Scale Balance | 4-point analytical balance | ||
| Stop watch | Non-Scientific equiptment | ||
| Eluent collection vials | Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials | ||
| HPLC Vials | Will depend on instrument used | ||
| Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s) | Sigma Aldrich | Z232211 | |
| General Laboratory glassware | Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method | ||
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | |
| DPPH | Sigma Aldrich | D9132 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich | 17836 | |
| Ammonia | Sigma Aldrich | 320145 | Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | |
| Fluorescamine | Sigma Aldrich | F9015 | |
| 4-aminoantipyrene | Acros Organics BVBA | AC103151000 | |
| Potassium ferricyanide | AnalaR | B10204-30 |
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