포스트 컬럼 유도체 화 반응 흐름 고성능 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여

Summary

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented.

Abstract

A protocol for the use of reaction flow high performance liquid chromatography columns for methods employing post column derivatization (PCD) is presented. A major difficulty in adapting PCD to modern HPLC systems and columns is the need for large volume reaction coils that enable reagent mixing and then the derivatization reaction to take place. This large post column dead volume leads to band broadening, which results in a loss of observed separation efficiency and indeed detection in sensitivity. In reaction flow post column derivatization (RF-PCD) the derivatization reagent(s) are pumped against the flow of mobile phase into either one or two of the outer ports of the reaction flow column where it is mixed with column effluent inside a frit housed within the column end fitting. This technique allows for more efficient mixing of the column effluent and derivatization reagent(s) meaning that the volume of the reaction loops can be minimized or even eliminated altogether. It has been found that RF-PCD methods perform better than conventional PCD methods in terms of observed separation efficiency and signal to noise ratio. A further advantage of RF-PCD techniques is the ability to monitor effluent coming from the central port in its underivatized state. RF-PCD has currently been trialed on a relatively small range of post column reactions, however, there is currently no reason to suggest that RF-PCD could not be adapted to any existing one or two component (as long as both reagents are added at the same time) post column derivatization reaction.

Introduction

포스트 컬럼 유도체 (PCD)과 결합 된 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC)의 분석 실험실에서 여러 문제를 해결하는 유용 강력한 도구이다. 이것은, ^1,2- 가능한 검출기의 스위트 그렇지 않으면 발견 할 수있는 화합물을 검출 선택적으로 검출 및 정량 ^3-5의 하한을 허용하거나 표적 피검의 신호를 증가시킬 수있는 것은 피하기 위해 타깃 분석 물을 유도체 화 매트릭스 효과 ^6. 일반적으로 사용되는 반응은 PCD 또는 ^{9,10 11,12} 카민, 2,2- 디 페닐와 반응성 산소 종의 유도체 (ROS) 닌히 드린 오르토 phthaladehyde ^7-9과 아미노산 등 아민의 반응을 포함 1 picrylhydrazil 라디칼 (DPPH ^{•)를 13, 14} 또는 2,2'- 아지노 비스 (3- ethylbenzothiazoline -6- 술폰산 (ABTS) ^{15, 16,} 및 황 C를 유도체 화하는 요오드화 지드 시약의 사용ontaining 화합물 ^{17, 18.}

HPLC 시스템 ⁶ PCD 반응의 사용에 대한 여러 결점 그러나있다. 주로 이들 중에서 혼합하고, 반응을 ⁸ 발생하기위한 시간을 허용하는 유도체 화 시약 (들) 및 상기 검출기의 첨가 시점 간의 반응 코일을 사용하는 것이다. 이러한 반응은 종종 HPLC 시스템 ^(19)의 나머지 부분의 부피에 비해 상당한 500 μL 이상의의 볼륨이 루프. 이러한 대량의 반응의 사용은 반응 루프가 존재하지 않고 관찰 될지에 비해 증가 된 피크 넓어짐 결과 루프. 이는 정량 및 검출 높은 한계가 짧고 넓은 피크 결과 부정적인 크로마토 해상도에 영향을 미친다. 1 및도 2는 다양한 후 열 반응 루프 볼륨의 추가 결과 피크 형상의 열화를 강조. 이 분석모바일 94 % 메탄올 위상 조성물 6 % 밀리 Q 물로 수행 하였다. 이동상의 유속은 1 ㎖ / 분으로하고, 주입 부피는 20 μL이었다 및 분석 파장은 265 nm였다. 20 μL 1,000 μL에서 죽은 볼륨을 변화 코일은 열 및 PCD 방법에서 반응 루프 죽은 볼륨의 효과를 시뮬레이션 할 수있는 검출기 사이에 삽입되었다. 이러한 루프는 0.5 mm 내경 스테인레스 스틸 튜브로 제조되었다. 실험은 제어기 (SCL-10AVP)로 이루어진 HPLC 시스템에서 수행하고, 저압 그라디언트 밸브 (FCL-10ALVP), 펌프 (LC-20AD), 인젝터 (SIL-10ADVP) 및 PDA 검출기 ( SPD-M10ADVP). 이동상 전에 HPLC 시스템으로 도입 탈기를 통해 펌핑 하였다. 분리는 250 mm X 4.6 mm ID가 5 μm의 컬럼을 사용하여 수행 하였다. 실험 조건은 최근 문헌에 게시 된 PCD 반응의 통상적으로 선택 하였다.

그만큼간단하게는, 일반적인 포스트 칼럼 반응기 설치 효과적으로 액체가 흐를 수 있으며, 반응이 일어날 수있는 가늘고 긴 튜브이다 비 분할 된 관형 반응기를 지칭한다. 이 시스템 피크 넓어짐은 단지 시스템에 추가 데드 볼륨뿐만 아니라, 이이 지마 등. ^(8)에 의해 강조된 상기 튜브의 내부 직경에 의존한다. 또한, 코일 형상이 관찰 된 브랜드의 폭이 넓어의 역할을한다. 반응기의 권취하면 불감 부피가 최소화 될 수 있다는 것을 의미 잘 혼합의 결과로, 보조 유동 프로파일을 변경하는 것을 스튜어트 ²⁰ 밝혔다. ²¹ 코일 니트 열린 관을 사용하는 경우 피크 폭이 넓어은 중요하지 않습니다 것을 주장하고있다. 피크 넓어짐이 지나치게 큰 경우, 리액터의 다른 형태는 ^{(20, 22)를} 고려할 수있다. 이 침대 원자로 또는 분할 흐름 반응기를 포함 할 수있다. 이 원자로는 달리의 requir 것 느린 반응에 특히 유용하다전자 큰 반응이 반복됩니다. 비 단편화 된 관형 반응기는 PCD의 응용 프로그램에서 사용되는 반응기의 가장 일반적인 유형의 반응기 설정이 유형의 상품이 문서의 나머지 부분은 같다.

반응 플로우 (RF) 컬럼 디자인은 이동상이 외측에 위치하는 반경 방향 중앙 열의 영역 또는 세 개의 포트에 위치한 하나의 포트 중 하나를 통해 열을 종료 (또는 입력) 할 수있는 멀티 – 포트 단부 피팅을 포함 칼럼의 벽 영역 (도 3 참조). 이 두 스트림은 열 벽 밖으로 확장하는 외부 다공성 프릿에 둘러싸여 차례에 불 침투성 링에 둘러싸여 중앙 다공성 프릿을 포함하는 최종 피팅을 사용하여 분리된다. 때문에 중앙 불 침투성 링 크로스 흐름에 두 개의 다공성 영역 사이 수 없습니다.

반응물 흐름 크로마토 동안 유도체 화 시약 (들)은 하나 또는 TW로 이동상 흐름의 방향에 대해 펌핑반응 유동 열의 외측 포트 O. 컬럼 용리액이 자유로운 외부 포트를 통해 외부 프릿의 유도체 화 시약 (들)과 혼합되어 검출기로 전달된다. 반응 흐름 중 하나의 시약 유도체 사용할 수 있습니다 또는 듀얼 시약 시스템합니다 (유도체 화 시약 2 포트와 1 포트에 연결합니다 (유도체 화 시약 1 포트, 1 포트는 검출기 1 포트 차단에 열 용출액을 전달하는) ) 검출기에 열 리제를 전달합니다. 중앙 스트림의 흐름은 어느 underivatized 칼럼 용출액 효과적으로 다중화 검출부 ^(23), 폐기물 전달을 검출하는데 사용될 수있다.

RF-PCD 크로마토 그래피를 실행하는 중앙 및 주변 유동의 비율이 때 사용할 하나의 주요 튜닝 방법. 각 유도체의 최적 비율은 중앙 유동 검출 또는 폐기물 전달할지 여부와 같은 요인에 달려있다. 따라서, 최적의 비율이 결정되면이를 적절한 유동 비율은 각 실행이 수행되기 전에 달성되는 것이 보장되어야한다.

또한 프릿의 사용은 컬럼 용리액 스트림 전형적 제로 데드 볼륨 T 피스 또는 낮은 데드 볼륨을 사용하는 기존의 혼합 기법에 비해 더 효율적인 믹싱 RF-PCD 결과에서 유도체 화 시약을 혼합하는 것으로 밝혀졌다 W- 작품은 두 개의 스트림을 혼합합니다. 이는 상대적으로 작은 반응 루프의 사용을 허용하거나, 완전히 반응 루프 심지어 제거 하였다. 전통적인 포스트 컬럼 유도체 화 방법에 비해 선명한 피크에서의 반응 루프의 크기 결과의 감소. 이 모든 컬럼 용리액이 유도된다는 사실에도 불구하고 대 잡음비 큰 신호가 관찰되고, 검출 및 정량 하한값 따라서 달성 할 수 있다는 것을 의미한다.

반응 유동 크로마토 그래피 PCD 반응의 적응에 어려움을 극복하기 위해 개발 된때문에 많은 양의 반응 루프 사용의 필요성으로 인한 큰 포스트 칼럼 죽은 볼륨 현대 HPLC 컬럼 및 시스템 확대 밴드에 의한 효율 특히 손실의. 종래의 PCD에 비해 RF-PCD에보다 효율적인 혼합 공정은 작은 반응 루프 볼륨 관측 분리 효율의 증가로 이어지는 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 또한 RF-PCD 크로마토 두 신호가 증가하고, 종래의 PCD 법에 비해 검출 및 정량 하한값의 결과 PCD 종래 기술에 비해 노이즈 감소이다. PCD 종래의 방법에 비해 RF-PCD의 추가적인 장점은 RF 열의 중앙 포트뿐만 아니라 칼럼의 주변부로부터 용출 유도 된 스트림으로부터 용출 underivati​​zed 스트림을 모니터링 할 수있는 능력이다. RF-PCD는 기존의 PCD의 방법에 비해 많은 장점을 표시하는 비교적 새로운하지만 유망한 기술이다.

<p class="jove_content">는 RF 열 연결은 큰 차이가 RF 열에 피팅의 개수로되는 종래의 HPLC 칼럼과 거의 동일한 방식으로 달성된다. HPLC 시스템 표준 HPLC 컬럼을 연결하는 피팅은 HPLC 시스템에 RF 열을 연결하는 데 사용될 수있다.

Protocol

주의 : (메탄올에 대한, 즉 MSDS)를 사용하기 전에 모든 재료 및 시약에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 용매 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 용리액을 처리 할 때 모든 적절한 안전 관행의 사용을 확인합니다. HPLC, 분석 균형과 검출기 장비의 공학적 통제의 적절한 사용을 보장하고, 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발)의 사용을 보장합?…

Representative Results

RF-PCD에 의해 사용하기 위해 적응 된 제 PCD 방법은, 2,2- 디 페닐 -1- picrylhydrazil 라디칼 (DPPH •) (24)를 사용하여 항산화 물질의 유도체이다. 이 반응은. Koleva 등의 알 25를 도입 널리부터 사용되어왔다. 검출은 반응성 산소 종의 존재하에, DPPH 라디칼 • 탈색, 관측 흡광도 저하 항산화 결과에 따라서 존재에 의존한다. DPPH • 반응은 종종 500 μL 또?…

Discussion

RF-PCD는 밴드 넓히는 효과를 최소화하고 분리 성능을 향상 반응 코일을 사용하지 않고 폐수 HPLC 포스트 컬럼 유도체 화 시약의 효과적인 혼합을 허용한다. RF-PCD 방법은 또한 검출 방법에 대한 신호 응답의 개선을 보여 주었다. Camenzuli 등. ^(28)는 에스프레소 커피 샘플에서 ROS의 검출에 대한 DPPH ^•와 반응 흐름 컬럼의 사용을보고하는 첫번째이었다. 이들 연구는 각종 DPPH ^?…

Materials

HPLC instrument	Agilent	1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatisation system	Shimadzu	LC-20A
RF colum			Non-commercial
PEEK tubing	Sigma Aldrich	Z227307
Column stoppers			Provided with column
PEEK tube cutter	Sigma Aldrich	Z290882
Analytical Scale Balance			4-point analytical balance
Stop watch			Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials			Any Small vial with a flat bottom will do e.g. HPLC vials
HPLC Vials			Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatisation solution(s)	Sigma Aldrich	Z232211
General Laboratory glassware			Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method
Methanol	Sigma Aldrich	34860
DPPH	Sigma Aldrich	D9132
Ammonium Acetate	Sigma Aldrich	17836
Ammonia	Sigma Aldrich	320145	Corrosive
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34998
Fluorescamine	Sigma Aldrich	F9015
4-aminoantipyrene	Acros Organics BVBA	AC103151000
Potassium ferricyanide	AnalaR	B10204-30