Stamcellsliknande<em> Xenopus</em> Embryonala Explantat att studera tidig Neural Utvecklings funktioner<em> In Vitro</em> Och<em> In Vivo</em

Summary

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Abstract

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Introduction

Det ryggradsdjur nervsystemet utträder från neurala plattan som ett homogent skikt av neuroepitelceller. Att förstå hur utvecklingsprogram induceras, kodas, och etablerades under regionalisering av neurala plattan är för närvarande ett viktigt mål i utvecklingsbiologi. Jämfört med andra system, är den experimentellt mottaglig Xenopus embryo en modell av val för att analysera tidiga stegen av neural utveckling ^1,2. Det är lätt att få ett stort antal embryon, och extern utveckling ger tillgång till de allra första stegen i neurulation ^3. Många verktyg är tillgängliga för att experimentellt manipulera Xenopus laevis (X laevis) embryonal utveckling. Mikroinjektion av mRNA eller morpholinos (MO), inklusive inducerbara MO, tillsammans med biokemiska och farmakologiska verktyg, möjliggör kontrollerat funktionsökning (GOF) och förlust av funktion (LOF) och specifik förändring av signalvägar ^4,5. Blastocoel tak ektoderm, ligger runt djuret polen i en blastula eller en mycket tidig gastrula embryo, och kallas "Animal Cap" (AC), är en källa av pluripotenta celler som kan programmeras genom manipulation av genuttryck före Explantat beredning. I detta manuskript är detaljerade protokoll att använda X. laevis AC explants att testa in vitro och in vivo molekylära mekanismer och cellulära processer som ligger bakom neurala utveckling.

En teknik presenteras, vilket gör fina observation av genexpressionsmönster i en Xenopus grodyngel neuralrörsdefekter, ett första steg i fastställandet av ödet bestämnings ledtrådar. Medan observationen av platta monterade vävnader används vanligen i studien av kycklingembryon ^6, har det inte blivit korrekt beskrivits i Xenopus. Manipulering av genuttryck genom att injicera syntetisk mRNA eller MO i blastomerer av 2 eller 4 cell skede embryon tillåter programmering av ACExplantat ^4. Exempelvis hämning av benmorfogenetiskt protein (BMP) -vägen genom uttryck av anti-BMP-faktor Noggin, ger en neural identitet till AC-celler ^3. Protokollet specificeras för utförande lokal och tidsstyrt exponering av växelströms explantat till extrinsiska ledtrådar via direkt kontakt med ett anjonbytarharts pärla. Äntligen en teknik beskrivs för att testa utvecklings egenskaper hos neurala stamceller in vivo genom transplantation av blandade explantat framställda från olika programmerade celler dissocierade och åter associerade.

Grodan embryo är en kraftfull modell för att studera tidiga ryggradsdjur neural utveckling. Kombinera manipulation av genuttryck till explantation in vitro kulturer ger viktig information i studiet av neuroepithelium regionalisering, spridning och morfogenes ^7-12. Programmeringen av AC explants tillåtet utvecklingen av en fungerande hjärta ex vivo ^13,14. Användningenav Explantation ympning ¹⁵ ledde till identifieringen av den minimala transkriptions omkopplaren inducerar neurallisten differentieringsprogram ^16. Zona limitans intrathalamica (ZLI) är en signalering som utsöndrar sonic hedgehog (Shh) för att kontrollera tillväxten och regionaliseringen av den kaudala framhjärnan. När löpande utsatt för Shh, neuro celler samuttrycker de tre transkriptionsfaktorgener – barH liknande homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) och Iroquois-3 (irx3) – förvärvar två egenskaper hos ZLI facket: befogenhet att uttrycka shh, och förmågan att segregera från främre neurala plattceller. Som modellsystem, kommer induktion av en ZLI öde i neuro celler presenteras ^8.

Dessa protokoll syftar till att ge enkla, billiga och effektiva verktyg för utvecklingsbiologer och andra forskare att utforska den grundläggande mechanisms av viktiga nervcells beteenden. Dessa protokoll är mycket mångsidig och tillåter undersökning av ett stort utbud av yttre och inre neurala bestämnings ledtrådar. Det tillåter långsiktigt in vivo analys av neurala härstamning engagemang, induktiva interaktioner och cell beteenden.

Protocol

Experiment överensstämmer med nationell och europeisk lagstiftning om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och med internationella principer för ersättning, begränsning och förfining. 1. Platt-montering av Xenopus laevis grodynglar Anterior Neural Tube Efter Whole-mount In Situ Hybridisering Erhåll X. laevis embryon enligt standardprocedurer 4 och ålder dem tills de når neurula etapp 26 år och äldre (enligt Nieuwk…

Representative Results

Baserat på morfologiska överväganden i olika arter, embryologiska manipulationer och uttrycksmönstret av reglerande gener, har en konceptuell modell som neurala plattan är uppdelad i tvärgående och längsgående segment som definierar en utvecklings rutnät genere distinkta histogenic fält. I neurala plattan, är primordia av framhjärnan, mitthjärnan, bakhjäman och ryggmärg alla redan etablerade längs antero-posterior (AP) axel under gastrulation (ses över 23-25).</sup…

Discussion

Neural utveckling iscensatt av ett komplext samspel mellan cellulära utvecklingsprogram och signaler från de omgivande vävnaderna (Omdömet på ^3,31,32). Här beskriver vi en uppsättning protokoll som kan användas i X. laevis embryon att utforska yttre och inre faktorer som neurala öde beslutsamhet och neurala morfogenes in vitro och in vivo. Dessa protokoll kan användas som sådan på X. tropic embryon emellertid X. tropic embryon är fyra…

Materials

Paraformaldehyde	VWR	20909.290	Toxic
anion exchange resin beads	Biorad	140- 1231
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A-7888	For culture of animal cappH 7.6
Gentamycine	GIBCO	15751-045	antibiotic
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A7906	for bead preparation