제노푸스 배아에서 배반구의 지붕에 있는 세포는 만능이며 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 양서류 배반구 지붕 외식을 분석 시스템으로 사용하여 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 체외 기능을 조사하는 프로토콜에 대해 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
신경 발달의 기초가 되는 유전 프로그램을 이해하는 것은 발달 및 줄기 세포 생물학의 중요한 목표입니다. 양서류 포반에서 배반구의 지붕에서 나온 세포는 만능입니다. 이러한 세포는 분리될 수 있으며, 유전자 발현 조작 또는 모르포겐에 의한 유도를 통해 다양한 조직을 생성하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 이 원고에서는 Xenopus laevis blastocoel 지붕 외식식물을 초기 신경 발달의 주요 생체 내 및 시험관 내 기능을 조사하기 위한 분석 시스템으로 사용하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜을 통해 운명 획득, 세포 이동 행동, 세포 자율 및 비자율적 특성을 조사할 수 있습니다. 배반구 지붕 외식은 혈청이 없는 정의된 배지에서 배양하고 숙주 배아에 접목할 수 있습니다. 이러한 배아로의 이식을 통해 장기적인 계통 헌신, 유도 특성 및 생체 내에서 이식된 세포의 거동을 조사할 수 있습니다. 이러한 분석은 신경 발달의 기초가 되는 분자 메커니즘, 세포 과정 및 유전자 조절 네트워크를 조사하는 데 활용될 수 있습니다. 재생 의학의 맥락에서 이러한 분석은 약물 스크리닝에 사용할 수 있는 신경 유래 세포 유형을 in vitro에서 생성할 수 있는 수단을 제공합니다.
서론
척추 동물의 신경계 세포의 neuroepithelial 균질 층으로서 신경 판으로부터 나온다. 개발 프로그램은 신경 판의 지역화 동안, 유도 인코딩 설립하는 방법을 이해하는 것은, 현재, 발달 생물학의 주요 목표입니다. 다른 시스템에 비해, 실험적 의무 Xenopus의 배아는 신경 발달의 초기 단계 1,2- 분석을위한 선택의 모델이다. 이 배아의 큰 숫자를 얻기 쉽고, 외부 개발 neurulation 3의 첫 번째 단계에 액세스 할 수 있습니다. 많은 도구를 실험적으로 Xenopus의 laevis의 (X를 laevis의) 배아 발달을 조작 할 수 있습니다. 마이크로 주입 함께 약리 도구를 유도 수법의 포함의 mRNA 또는 morpholinos (MO),의는, 함수의 이득 (GOF)과 기능 (LOF)의 손실과 경로 4,5 신호의 특정 변경을 제어 허용한다. 즐stocoel 지붕 외배엽은 포배, 또는 초기 낭배 배아 동물 기둥 주위에 위치하며 "동물 캡 '(AC)라고도 유전자 발현 이전에의 조작에 의해 프로그램 될 수있는 다 능성 세포의 공급원은 준비 외식. 이 원고 X.를 사용하는 상세한 프로토콜은 laevis의 교류 외식은
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
실험은 과학적 목적 및 교체, 감소 및 정제 국제적으로 확립 된 원칙에 사용되는 동물의 보호에 관한 국가와 유럽의 규정을 준수합니다.
Xenopus의 1. 평면 장착 후 올챙이 앞쪽에 신경 튜브를 laevis의 현장 하이브리드에서 전체 마운트
- X를 얻습니다 표준 절차 4 그들이 26 세 이상 (Nieuwkoop 및 페이버 발달 테이블 (17)에 따라 neurula 단계에 도달 할 때까지 그들을 나이에 따라 배아를 laevis의.
- 수정 (X) 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 용액에 이들을 배양하여 laevis의 올챙이. 38 배아, 나중 단계에서 배아에 대한 실온에서 2 시간 무대 무대 26, 1 실온에서 시간 1.5을 바위와 2 mL 유리 병에 배아를 돌립니다.
주의 : PFA는 연락처 및 의심되는 발암 물질에 의한 독성. 그것은 후드 아래에 조작해야합니다.
참고 : 하나의 X를 laevis의의 무리입니다보통 2 mL 유리 바이알에 고정되지만 큰 유리 바이알이 사용될 수있다. - 두 번, 0....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
다른 종, 배아 조작 및 조절 유전자의 발현 패턴의 형태를 고려하여, 개념적 모델은 신경 판 구별 histogenic 필드를 생성 발달 그리드를 정의하는 가로 및 세로의 세그먼트로 분할되어 있음을 보유하고있다. 신경 판에서 전뇌, 중뇌, 후뇌와 척수의 primordia 모든 이미 (23-25 검토) 낭 배기 중에 안테 - 후부 (AP) 축을 따라 설정됩니다. neurulation 동안 histogenic 필드는 유전자 발현의 공간적으로 제한된 영역으로 검출 할 수있다. 조절 유전자의 발현 패턴에 기초하여, 전뇌 primordium는 prosomeres (p)라고 구별 histogenic 필드를 생성 횡 여섯 개의 세그먼트로 분할된다. 각 prosomere은 복부 (기초)와 (26, 27에서 검토) 지느러미 (ALAR) 부분으로 나누어 져 있습니다. 양서류에서, prosomere 2(P2)는 epithalamus 및 시상 및 그.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
신경 개발은 (3,31,32 검토) 주변 조직에서 세포 발달 프로그램과 신호 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조율된다. 여기서 우리는 X.에 사용될 수있는 프로토콜의 집합을 기술 외부 및 신경 운명 결정과 시험관 및 생체 내에서 신경 형태 형성에 관여하는 본질적인 요소를 탐구하는 배아를 laevis의. 이러한 프로토콜은 X.에 그대로 사용 할 수있다 tropicalis 배아 그러나 X. tropicalis 배아는 X의 다음 네 번 작은 배아를 laevis의. 모두 필요성을 사용하는 집게와 텅스텐 바늘은 미세한한다. 가능하면 X를 사용 laevis의.
X의 정확한 시각화 laevis의과 (X) tropicalis 신경 histogenic.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef 및 Anne Hélène Monsoro-Burq의 도움과 조언, 그리고 퀴리 연구소의 동물 시설에 감사드립니다. 저자는 원고에 대한 편집 작업에 대해 Paul Johnson에게 감사를 표합니다. 이 작업은 Centre National de la Recherche Scientifique(CNRS UMR8197, INSERM U1024)와 "Association pour la Recherche sur le Cancer"(ARC 4972 및 ARC 5115; FRC DOC20120605233 및 LABEX Memolife) 및 Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039)가 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 파라포름알데히드 | VWR | 20909.290 | 독성 |
| 음이온 교환 수지 비드 | Biorad | 140- 1231 | |
| 소 혈청 알부민 | SIGMA | A-7888 | 동물 캡pH 7.6 |
| 겐타마이신 배양용 | GIBCO | 15751-045 | 항생제 |
| 소 세럼 알부민 | SIGMA | A7906 | 비드 준비용 |
참고문헌
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
