Fecale Glucocorticoïd Analyse: Niet-invasieve bijnier Toezicht op Equids
Summary
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.
Abstract
Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.
Introduction
De beschreven werkwijze beoogt corticosteron concentraties in paarden ontlasting analyseren om een niet-invasieve evaluatie van adrenale activiteit. Meten hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) as activiteit een geaccepteerde aanpak van de reactie op potentieel aversieve situaties zowel gevangen en huisdiersoorten bestuderen. De referentietechniek en de meest gebruikte methode is het gebruik van bloedplasma 1 hebben echter alternatieve werkwijzen zoals fecale analyse ontwikkeld om de stress veroorzaakt door bloedafname zichzelf te lossen en kan bijhouden loslopende species.
Tijdens een aversieve situatie wordt fysiologische homeostase verstoord. De hypothalamus in de hersenen releases corticotrophine releasing hormoon (CRH), die werkt op de hypofyse en stimuleert de afgifte van adrenocorticotroop hormoon (ACTH). ACTH in de bloedbaan en stimuleert de adrenale cortex specie scheidens specifieke glucocorticoïden (GC). Glucocorticoïden zijn nauw verbonden met stressvolle gebeurtenissen in plaats van constant geproduceerd in alle energie verhoogde staten daarom zijn ze vaak gemeten in voorkeur ten opzichte van andere stress-hormonen gekoppeld 2. Glucocorticoïden zijn verantwoordelijk voor verschillende adaptieve effecten bij paarden. Energie snel gemobiliseerd uit opslagplaatsen in het lichaam in de vorm van vetzuren en glucose wordt zuurstofopname verhoogd, sensibiliteit versterkt 3 en de bloedstroom wordt verminderd tot niet nodig voor beweging 4. Evenals als een coping-mechanisme, kan de stress veroorzaakte stijging van Glucocorticoïden ook helpen om het dier te bereiden op de volgende stressor 5.
Het beoordelen hormoonspiegels in het plasma en speeksel omvat het meten van de werkelijke circulerend hormoon echter meten metabolieten in de feces meet de metabole eindproduct van het hormoon. Circulerende steroïden worden gekataboliseerd in de lIver vóór excretie in de gal, waar ze verdere veranderingen vergemakkelijkt door de enzymatische activiteiten van de bacteriële flora in de darm nummer 6 ondergaan. Daarom kunnen immunotesten gericht bloed glucocorticoïden niet geschikt voor de analyse van fecale metabolieten glucocorticoïde 7 zijn.
Zoals fecale verzameling met geen verstoring van het paard kan worden uitgevoerd, analyse van feces voor corticosteron, wordt veelvuldig gebruikt om HPA te monitoren in een aantal omstandigheden. Verhoogde corticosteron in de uitwerpselen van paarden is gemeld in reactie op potentieel aversieve situaties zoals bij postoperatieve veterinaire behandeling 8 en 9 beperkende behuizing. Fecal bemonstering weerspiegelt een gepoolde glucocorticoïden niveau na verloop van tijd in plaats van het moment bemonstering aangeboden door plasma en speeksel waardoor het geschikt is voor het toezicht op de lange termijn, chronische of seizoenspatronen 10. Vanwege de niet-invasieveaard van de werkwijze kan herhaald worden monsters verzameld voor een individu zonder de noodzaak voor het vangen of bevestigingssysteem 11. Er moet echter soortspecifiek gut transittijd rekening worden gehouden bij de planning van een sampling protocol. Bij paarden gut reistijd is ongeveer 18 uur 12 derhalve bijnierrespons gevolgd corticosteron metabolieten kunnen worden in de feces gedetecteerd één dag na de eerste activering van de HPA-as.
Bij het gebruik van niet-invasieve immunoassaytechnieken zorgvuldige validatie van de soort onderzochte essentieel 13. Bovendien zijn sexeverschillen bij hormoon metabolietenuitscheiding is waarschijnlijk gemeld als gevolg van verschillen in metabolisme en een type corticosteron metaboliet in verschillende soorten, waaronder muizen 14 en 15 kippen. Het was dus belangrijk onderdeel van deze werkwijze dat de test werd gevalideerd voor gebruik in zowel mannelijke als vrouwelijke gedomesticeerde paarden zoals beschreven in The protocol. Dit verschil hormoon- tussen geslachten nog gevolgen voor datakwaliteit is zelden gericht en als onderdeel assay validatie.
Deze niet-invasieve methode maakt het mogelijk lange termijn evaluatie van de adrenaline-activiteit in de binnenlandse paarden. Het protocol gegevens zowel de validatie van de test en de test techniek zelf.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fecale corticosteron analyse geeft een evaluatieinstrument langdurige patronen van bijnieractiviteit bij paarden. De niet-invasieve karakter van de methode overwint de verstorende effecten van andere bemonsteringsmethoden gebruikt om de adrenaline-activiteit met inbegrip van speeksel en plasma-analyse 9 te beoordelen. Daarnaast heeft de techniek een duidelijk non-invasieve voordeel als het bestuderen van loslopende paarden.
Er zijn een aantal belangrijke punten te bespreken met be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding for the production of this manuscript was provided by Nottingham Trent University. The authors wish to thank the University yard manager, Anna Gregory for the use of her horses and provision of fecal samples for use in the protocol. Thanks also to Chester Zoo Wildlife Endocrinology Laboratory for use of their facilities.
Materials
| Corticosterone antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Cortisol antibody & HRP kit | Coralie Munro – UC Davis | NA | No longer available through UC Davis – please see Arbor Assays |
| Corticosterone synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 50-23-7 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Cortisol synthetic standard hormone | Sigma Aldrich | 15087-01-1 | Harnful if ingested or with skin contact. Use in fume cupboard |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67-56-1 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | 144-55-8 | Irritant |
| Sodium Carbonate Anhydrous | Sigma Aldrich | 497-19-8 | Irritant |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | 7558-79-4 | Irritant |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | 10049-21-5 | Irritant |
| BSA | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | Irritant |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | Irritant |
| Citric Acid | Sigma Aldrich | 77-92-9 | Irritant |
| ABTS | Sigma Aldrich | 30931-67-0 | Irritant |
| Hydrogen Peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | Irritant |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | 7647-14-5 | Irritant |
| Buffer capsules – pH 4 | VWR | 332732B | |
| Buffer capsules – pH 7 | VWR | 332742D | |
| Buffer capsules – pH 10 | VWR | 332762H | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 435570 | Irritant. Use in fume cupboard |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Irritant |
| Analytical balance | Fisher Scientific | BFS-525-010A | |
| Air compressor | |||
| Centrifuge | |||
| Computer +printer | |||
| fridge-freezer | |||
| Drying apparatus | |||
| +tubing | |||
| Flammable liquid storagecabinet | VWR | 649-002 | |
| Fume cupboard | |||
| Hot-plate stirrer | VWR | 640-282 | |
| Microplate reader | VWR | ||
| Microplate washer | VWR | ||
| pH meter | VWR | ||
| Eppendorf Research® pipettes – multipack option 2 | VWR | ||
| Pipette – 1000ul | VWR | ||
| Pipette – 200ul | VWR | ||
| Pipette – 20ul | VWR | ||
| Repeater pipette | VWR | ||
| Pipette filler | VWR | ||
| Orbital shaker | Progen Scientific | ||
| Sonicator | Hilsonic | ||
| Vortex | VWR | ||
| Warm water bath | |||
| Water purification system | Millipore |
References
- Mormède, P., et al. Exploration of the hypothalamic-pituitary-adrenal function as a tool to evaluate animal welfare. Physiology and Behaviour. 92 (3), 317-339 (2007).
- Lane, J. Can non-invasive glucocorticoid measures be used as reliable indicators of stress in animals?. Animal Welfare. 15 (4), 331-342 (2006).
- Morgan, K. N., Tromborg, C. T. Sources of stress in captivity. Applied Animal Behaviour Science. 102, 262-302 (2007).
- Nelson, R. J. . An introduction to behavioural endocrinology (3rd Ed). , 670-671 (2005).
- Sapolsky, R. M., Romero, L. M., Munck, A. U. How Do Glucocorticoids Influence Stress Responses? Integrating Permissive, Suppressive, Stimulatory, and Preparative Actions. Endocrine Reviews. 21 (1), 55-89 (2000).
- Macdonald, K. M., Macdonald, I. A., Bokkenheuser, V. D., Winter, J., McLernon, A. M., Mosbach, E. H. Degradation of steroids in the human gut. Journal of Lipid Research. 24, 675-700 (1983).
- Young, K. M., et al. Non-invasive monitoring of adrenocortical activity in carnivores by fecal glucocorticoid analysis. General and Comparative Endocrinology. 137, 148-165 (2004).
- Merl, S., Scherzer, S., Palme, R., Mostl, E. Pain causes increased concentrations of glucocorticoid metabolites in horse faeces. Journal of Equine Veterinary Science. 20, 586-590 (2000).
- Yarnell, K., Hall, C., Royle, C., Walker, S. L. Domesticated horses differ in their behavioural and physiological responses to isolated and group housing. Physiology and Behaviour. 143, 51-57 (2015).
- Wielebnowski, N., Watters, J. Applying fecal endocrine monitoring to conservation and behaviour studies of wild mammals: important considerations and preliminary tests. Israel journal of ecology and evolution. 53, 439-460 (2007).
- Palme, R. Measuring fecal steroids: guidelines for a practical application. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 75-80 (2005).
- Uden, P., Rounsaville, G. R., Wiggans, G. R., Van Soest, P. J. The measurement of liquid and solid digesta retention in ruminants, equines and rabbits given timothy hay. British Journal of Nutrition. 48, 329-339 (1982).
- Goymann, W. Non-invasive monitoring of hormones in bird droppings: biological validations, sampling, extraction, sex differences and the influence of diet on hormone metabolite levels. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 35-53 (2005).
- Touma, C., sachser, N., Mostl, E., Palme, R. Effects of sex and time of day on metabolism and excretion of corticosterone in urine and feces of mice. General and comparative Endocrinology. 130, 267-278 (2003).
- Rattenbacher, S., Mostl, E., Hackl, R., Ghareeb, K., Palme, R. Measurement of corticosterone metabolites in chicken droppings. British Poultry Science. 45, 704-711 (2004).
- Yarnell, K., Hall, C., Billett, E. An assessment of the aversive nature of an animal management procedure using behavioural and physiological measures. Physiology & Behaviour. 118, 32-39 (2013).
- Goymann, W. On the use of non-invasive hormone research in uncontrolled, natural environments: the problem with sex, diet, metabolic rate and the individual. Methods in Ecology and Evolution. 3, 757-765 (2012).
- Sheriff, M. J., Dantzer, B., Delehanty, B., Palme, R., Boonstra, R. Measuring stress in wildlife: techniques for quantifying glucocorticoids. Oecologia. 166, 614-619 (2011).
- Watson, R., Munro, C. J., Edwards, K. L., Norton, V., Brown, J. L., Walker, S. L. Development of a versatile enzyme immunoassay for non-invasive assessment of glucocorticoid metabolites in a diversity of taxonomic species. General Comparative Endocrinology. 186, 16-24 (2013).
- Touma, C., Palme, R. Measuring fecal glucocorticoid metabolites in mammals and birds: the importance of validation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1046, 54-74 (2005).
- Millspaugh, J. J., Washburn, B. E. Use of fecal glucocorticoid metabolite measures in conservation biology research: considerations for application and interpretation. General and Comparative Endocrinology. 138, 189-199 (2004).
