Optisk kontrol af levende celler Elektrisk aktivitet ved Conjugated Polymers

Summary

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Abstract

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.

In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Introduction

Muligheden for at manipulere den cellulære aktivitet med en præcis rumlig og tidsmæssig opløsning repræsenterer en vigtig strategi i neurovidenskabelig forskning og behandling af neurologiske og psykiatriske lidelser. Er ¹ Traditionelle metoder baseret på elektrisk stimulation af celler ved hjælp af elektroder placeret i nærhed eller i kontakt med målrettet system ^{2, som} kan være af forskellig kompleksitet (enkelt celle, mobilnetværk, hjerneskiver, in-vivo hjernevæv). I det forløbne århundrede har brugen af ​​patch-clamp, metal og substrat-integrerede elektroder givet et detaljeret billede af fysiologi og patofysiologi af enkelte neuroner og de fungerende mekanismer neurale netværk. Men elektrisk stimulering lider vigtige begrænsninger. Den første er forbundet med en generelt dårlig rumlig opløsning på grund af de fysiske dimensioner af elektroderne og deres faste geometri, som ikke let kan tilpassestil komplekse organiserede systemer som biologisk væv. Ligeledes kan problemer i forbindelse med elektroderne impedans og krydstale mellem stimulering og registreringssystemer forringes den endelige signal-til-støj-forholdet for målingerne. ³ På den anden side kan anvendelsen af lys til stimulering bidrage til at overvinde mange begrænsninger af den elektriske tilgang. Først og fremmest, det giver en hidtil uset rumlige (<1 um) og tidsmæssig opløsning (<1 ms), hvilket gør det muligt at målrette specifikke celletyper eller endda sub-celle rum. Desuden er det særdeles ikke-invasiv, idet den undgår fysisk kontakt med vævet af interesse og disentangles stimulation fra optagelsen. Desuden kan både lysintensiteten og bølgelængde styres nøjagtigt og dermed forskellige stimuleringsprotokoller kan anvendes. ^3,4

Men langt størstedelen af ​​dyreceller ikke nogen specifik lysfølsomhed. Adskillige strategier for optisk stimulation er således blevet foreslået, enten udnytte lysfølsomme molekylære mediatorer i nærheden eller i cellerne, eller ved hjælp af fotoaktive enhed placeret eksternt tæt til cellen. Førstnævnte kategori refererer til endogene mekanismer som stimulering via synlige eller infrarøde (IR) lys, samt anvendelse af enten fotoisomeriserbare / fotospaltelig forbindelser eller den genetiske ekspression af lysfølsomme molekylære aktuatorer (optogenetics). Sidstnævnte klasse omfatter teknikker til exogen stimulering opnås ved anvendelse af uorganiske nano / micro-partikler eller fotoledende siliciumsubstrater. ⁵ Alligevel alle disse systemer har lyse sider og ulemper. Navnlig er svag og ikke pålidelige endogene absorption af celler i det synlige område og den ledsagende generering af reaktive oxygenarter kan være skadeligt for cellen. Generelt er IR anvendes til at inducere lokal termisk opvarmning på grund af vandabsorption, men ekstinktionskoefficienten for vand er lille, hvilket således kræver strong infrarødt lys (fra ti til hundredvis af W / ^mm2), der er vanskelig at levere via standard mikroskop optik og kan udgøre sikkerhedsmæssige bekymringer for in vivo-applikationer. På den anden side, tilgængeligt omstillelige anbringelse i bur forbindelser har en tidsbegrænset handling og kræver ofte UV-lys, der er svært at levere på grund af begrænset vævspenetration. Desuden lider de diffusionsproblemer af de aktiverede forbindelser upon fotolyse uden det belyste område. Endelig har optogenetic værktøjer tilladt forskere til at målrette specifikke cellulære delpopulation og undersektioner, og er hurtigt fremstår som en af ​​de vigtigste teknologier i neurovidenskabelig forskning. Men indsættelse af et exogent DNA-segment via en viral vektor rejser vigtige sikkerhedsspørgsmål, navnlig i betragtning af vedtagelsen den menneskelige patienter. ^5,6 Af disse grunde forskning i nye materialer og apparater, som kan celle optisk manipulation er et meget varmt emne.

For nylig er en hidtil ukendttilgang baseret på anvendelsen af ​​lysfølsomme konjugerede polymerer, i stand til effektivt at transducere et optisk stimulus i en modulering af celle elektrisk aktivitet, er blevet foreslået. The Cell Stimulering af Polymer fotoexcitering (CSPP) teknik udnytter mange vigtige-aktivere funktioner typisk af organiske halvledere: de er uløseligt følsomme over for lys i det synlige område, ⁷ de er biokompatible, blød og komfortabel og deres mekaniske fleksibilitet tillader en intim grænseflade med væv både in vitro og in vivo ^8-10. Bortset fra det, kan de let funktionaliseres til bedre at tilpasse sig grænsefladen med levende celler, og for at muliggøre specifik excitation, sondering og sensing kapaciteter. ^11,12 Desuden de understøtter elektroniske såvel som ionisk transport, hvilket gør dem ideelle for kombinationen af elektronik ad biologi. ^13,14 interessant, kan de arbejde i solcelle-tilstand, så man undgår behovet for at anvende en ekstern skævhed feller effektiv celle optisk stimulation. ¹⁵

Pålideligheden af CSPP teknik er tidligere blevet påvist i flere systemer, herunder primære neuroner, ^{15,16 astrocytter,} 17 sekundære cellelinier ^{18 og} eksplanterede retinale væv. ^16. I dette arbejde, alle de nødvendige skridt til at fabrikere en lysfølsom bio-polymer grænseflade ¹⁹ til optisk stimulering af in vitro-systemer er beskrevet i detaljer. Som en undersøgelse tilfælde en prototypisk organisk solcelle blanding af region-regelmæssig poly (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), fungerer som elektron donor, og phenyl-C61-smørsyre-syre-methyl ester (PCBM), der fungerer som elektronacceptor anvendes. Som det biologiske system, der er menneskelige embryonale Nyre (HEK-293) celler anvendes. Et eksempel på en photostimulation protokol med den relative registrering af celleaktivitet via elektrofysiologiske målinger er tilvejebragt.

Den beskrevne platformer imidlertid af almen gyldighed, og det kan let udvides til anvendelse af andre konjugerede polymerer (ved passende justering af opløsningen fremstillingsprocessen og deposition parametre), forskellige celletyper (ved passende at ændre cellekultur-protokollen, plating procedure og ønskede tidspunkt for celle såning og spredning) samt forskellige stimulation protokoller (lys bølgelængde, stimuli hyppighed og varighed, fotoexcitering tæthed).

Protocol

1. Fremstilling af Fotoaktive Substrater Forbered en P3HT: PCBM opløsning (1: 1 vægt / vægt) i chlorbenzen ved en P3HT koncentration på 20 g / L. Bland opløsningen med en magnetomrører i mindst 4 timer ved 60 ° C. Overvej en volumen på 150 pi af opløsning for hvert substrat, der skal fremstilles. Ren ITO-coatede objektglas (R s = 10 Ω / sq, 18×18 mm 2, tykkelse 170 um) med fortløbende bade deioniseret vand, acetone og isopropanol i en sonikator (10 min for hvert trin…

Representative Results

Celler kan let dyrkes på P3HT: PCBM substrater, forudsat at en passende adhæsion lag aflejres (ligesom fibronectin anvendt i trin 3.2 i den beskrevne protokol). P3HT: PCBM optisk absorptionstoppe i den grønne del af det synlige spektrum; imidlertid kan vælges andre lysfølsomme konjugerede polymerer, ifølge den foretrukne photostimulation bølgelængder område (figur 2). Biokompatibilitet disse substrater er blevet påvist ikke kun med cellelinier 18,21 …

Discussion

Kritiske trin i den rapporterede protokol for in vitro optiske stimulering af celler vedrører primært valget af den lysfølsomme polymer, de termiske steriliseringsparametre, intensiteten og varigheden af lysstimuli. En P3HT: PCBM tynd film blev valgt her, da den sikrer god tidsmæssig og elektrokemisk stabilitet. Man bør dog bemærke, at ikke alle lysfølsomme polymerer kan tilbyde analoge forestillinger, ²² mere specifikt på belysning. Hertil kommer, i dette tilfælde valgt varmesterilisering p…

Materials

rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO-coated substrates	Nano-CS	IT10300100
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
chlorobenzene	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetone	Sigma Aldrich	270725
isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	563935
HEK cells	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-
FBS	LGC standards srl	ATCC-30-2020