העבודה המוצעת מעריכה את פוטנציאל האבחון של תהודה plasmon משטח ישירה ומוגברת מבחני (SPRi), במיוחד לצורך זיהוי של הורמון גדילה האנושי רקומביננטי בסרום אנושי ממוסמר, על ידי השוואת תוצאות SPRi ישירות עם assay immunosorbent צמוד אנזים זמין מסחרי (ELISA) קִיט.
שיטות רגישות וסלקטיבית לצורך זיהוי של הורמון גדילה האנושי (HGH) על פני טווח רחב של ריכוזים (רמות גבוהות של 50-100 ng מיליליטר – 1 ורמות מינימום של 0.03 מיליליטר ng – 1) במחזור הדם הוא חיוניים כמו רמות משתנים רשאי מצביע פיזיולוגיה שינתה. לדוגמא, ניתן לאבחן הפרעות צמיחה המתרחשות בילדות על ידי מדידת רמות של HGH בדם. כמו כן, השימוש לרעה של HGH רקומביננטי בספורט מהווה לא רק בעיה אתית זה גם מציג איומים בריאותיים חמורים למתעלל. אסטרטגיה פופולרית אחת למדידת שימוש לרעה HGH, מסתמכת על הגילוי של היחס של 22 kDa hGH לhGH הכוללת, כמו רמות אנדוגני אינם 22 kDa לרדת לאחר מתן אקסוגני רקומביננטי HGH (rhGH). הדמיה בתהודה plasmon פני השטח (SPRi) היא כלי אנליטי שמאפשר ניטור ישיר (ללא תווית) והדמיה של אינטראקציות biomolecular על ידי הקלטה של שינויי ind השבירהלשעבר בסמוך למשטח החיישן בזמן אמת. לעומת זאת, בשיטת colorimetric הנפוצה ביותר בשימוש, assay צמוד האנזים immunosorbent (ELISA) משתמש נוגדני זיהוי אנזים שכותרתו למדוד ריכוז אנליטי בעקיפין לאחר התוספת של מצע שגורם לשינוי צבע. כדי להגדיל את רגישות זיהוי, SPRi המוגבר משתמש בפורמט assay כריך ונקודות קרובים אינפרא אדום קוונטים (QDs) כדי להגדיל את עוצמת אות. לאחר זיהוי SPRi הישיר של rhGH רקומביננטי בסרום אנושי ממוסמר, אות SPRi מוגברת על ידי ההזרקה רציפה של נוגדן זיהוי מצופה QDs הקרוב אינפרא אדום (ננו-SPRi). במחקר זה, את פוטנציאל האבחון של SPRi הישיר והמוגבר הוערך למדידת rhGH זינק בסרום אנושי והשוואה ישירות עם היכולות של ערכת ELISA זמינה מסחרי.
הורמון גדילה אנושית (HGH) הוא פפטיד 191 חומצת אמינו (22 KDA) המיוצר על ידי בלוטת יותרת המוח וישירות משתחרר לתוך מחזור הדם. יחסי גומלין בין הורמוני ההיפותלמוס צמיחת פפטיד משחרר הורמון (GHRH) וסומטוטרופין לגרום הפרשות pulsatile של HGH. כתוצאה מכך, רמות של HGH להשתנות משיאים ב50-100 ng / ml לשפל בטווח 0.03 ng / ml 1. מחסור או עודף של HGH בגוף יכול לעורר מגוון רחב של תסמינים פיסיולוגיים נורמליים. לדוגמא, רמות עודפות של HGH יכולות להוביל לענקיות 2 וסוכרת 3. רמות המדולדלות של HGH לגרום סוכר בדם נמוך בתינוקות, וצפיפות עצם חלשה ודיכאון במבוגרים 4.
הממשל של טופס רקומביננטי של HGH (rhGH) משפר את מסת שריר רזה, תוך צמצום שומן בגוף. ככזה, חומר זה הפך תרופת בחירה לספורטאים מקצועיים וחובבים כזה משפר את הכוח פיזי שמעניק עו"דantage בספורט תחרותי. rhGH הוא מוחרם על ידי הסוכנות נגד השימוש בסמים העולמי (WADA) 5,6 ומאמץ רב על ידי חוקרים בינלאומיים כבר התמקדו בפיתוח בדיקות שיכולות לזהות את נוכחותה או השפעה אנבוליים.
assay immunosorbent צמוד אנזים (ELISA) היה השיטה המועדפת לקביעה של HGH בכל דם 7. אמנם, ELISA הוא טכניקה אמינה המציעה רגישות טובה וסלקטיביות, זה יחסית זמן ועתיר עבודה. בנוסף, ELISA מסתמך על הגילוי העקיף של HGH על ידי העסקת תגים האנזימטית. לעומת זאת, תהודת plasmon פני השטח (SPR) מאפשרת זיהוי של HGH ישירות ללא השימוש בתוויות בזמן אמת. עיקרון הגילוי מאחורי SPR כרוך משטח חישה בהיקף של פריזמה שמצופית בשכבה דקה מתכת (זהב או כסף); כאשר אור מקוטב מונוכרומטי אינטראקציה עם משטח המתכת, "plasmons המשטח" נוצרים. כריכה של אנליטילקולט משטח משותק על משטח המתכת מדאיג את תנאי התהודה וכתוצאה מכך לטבול תהודה עברה, אז מה שיכול להיות מתואם לריכוז אנליטי. חיישנים מבוססי SPR זמינים מסחרי המציעים בזמן אמת, טכניקה ללא תווית לעקוב אחר אירועים מחייבים biomolecular ותגובות ביוכימיות 8-10 עכשיו. לאחרונה, SPRi פותח בתגובה לצורך בריבוב (כלומר, ניטור אירועים מרובים מחייבים בו זמנית), שלא היו אפשרית בחיישני SPR קלאסיים. לפיכך, SPRi התפתח ככלי לניטור מספר אירועים מחייבים בו-זמנית. מערכות SPRi נוכחית מבוססות על הדמיה מיקרוסקופית של משטח שמתלהב עם אור בזווית ואורך גל 10 ספציפיות. התמונה לאחר מכן נתפסה על מכשיר מערך תשלום מצמידים (CCD).
נכון להיום, יש כבר כמה מבחני מבוססי SPR פותחו כדי לזהות hGH 11-14. אסטרטגיה מסוימת אחת, הידועה בשם שיטת איזופורם 15, מסתמך על הגילוי של היחס של 22 kDa hGH לhGH הכוללת, כמו רמות אנדוגני אינם 22-kDa לרדת לאחר מתן rhGH אקסוגני. לאחרונה, דה חואן-פרנקו ואח '. 11 דיווחו על הפיתוח של immunosensor מבוסס SPR לגילוי סלקטיבית של kDa 22 ו -20 isoforms kDa הורמון הגדילה בדגימות סרום אנושיים. נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים לכל איזופורם היו משותקים ישירות על חיישן הזהב מאפשר המדידה של שני isoforms בו זמנית בזריקה אחת עם הגבלה של זיהוי על 0.9 ng מיליליטר -1. לחלופין, SPR נעשה שימוש כדי להקרין נוגדנים עם סגוליות גבוהות עד 13 HGH. אם הריכוז של אנליטי היעד נופל מתחת לגבול של מערכת SPRi של זיהוי (<ננומטר), יש לפנות להגברת אות SPRi באמצעות הניצול של חלקיקים (ננו-SPRi). הגברה מבוססת SPR כגון תועדה היטב בספרות 16-19 לנסוגי arious של אנליטי ומשטחים.
בעבודה זו, הפוטנציאל אנליטי של חיישנים מבוססים ננו-SPRi וSPRi נבדק, במיוחד לצורך זיהוי של rhGH בסרום אנושי ממוסמר, והשוואה של יכולת זיהוי שלה ישירות לELISA. הפרמטרים הבאים ייבדקו ונחשבו: זמן גילוי, רגישות, פרופיל הקינטית, שחזור וספציפיות.
רמות חריגות של HGH, הורמון טבעי, נמצאו קשורות להפרעות רפואיות רבות המשפיעות על צמיחה והתפתחות אנושיות. יתר על כן, ממשל אקסוגני של rhGH משמש בדרך כלל על ידי ספורטאים, למרות שזה אסור, כסוכן סמים כדי לשפר את הביצועים שלהם. אתגרים באיתור תוצאת שימוש לרעה rhGH מהקושי בהבחנה hGH אקסוגניים מטופס אנדוגני. ככזה, הטכניקה אושרה הנוכחית לאיתור hGH אקסוגניים מסתמכת על מדידת היחס של איזופורם kDa hGH 22 ביחס ל -20 איזופורם kDa. מאז דרישות מבחן איזופורם למדידה של HGH מרובה isoforms בו זמנית בתוך פרק זמן קצר במגוון רחב של ריכוזים, ולכן, אנו נחשבים פלטפורמת SPRi כהתאמה מושלמת. בנוסף, רמת ה- HGH אנדוגני להשתנות לרמה נמוכה מאוד (0.03 ng / ml) בזרם הדם ולכן מערכת האיתור חייבת להיות מסוגל למדוד טווח זה בנוחות עם גבוה specificity. כתוצאה מכך, אנחנו גם נחקרו במחקר זה את הפוטנציאל של ננו-SPRi ככלי אבחון לHGH והשווינו אותו ישירות עם SPRi וimmunoassay הקלאסי ELISA.
בהתבסס על תוצאות שהתקבלו ממחקר זה, היתרון העיקרי של שיטת SPRi וננו-SPRi הוא שריכוזי rhGH ניתן למדוד באופן מהיר יותר בהשוואה לשיטה המקובלת יותר ELISA. משך סטנדרטי למדידת רמות rhGH במדגם אחד עם שיטת זיהוי הישירה היה שעה 1 ואילו ננו-SPRi נדרש 2 שעות בשל צעדים נוספים בתהליך. בסך הכל, עם ניסויי SPRi וננו-SPRi, לפני ההזרקה של מדגם, צעד כיול מומלץ מאוד. בנוסף, ההזרקה של מדגם גולמי כמו תוצאות סרום אדם בכמה אינטראקציות שאינן ספציפיות כתוצאה זה הכרחי כדי להזריק חיץ לשטוף מלח גבוה לחשוף רק אינטראקציות ספציפיות. זה גם ראוי לציין כי שלב לשטוף הוא הכרחילאחר כניסתה של חסימת מולקולות על פני השטח החיישן, כדי להסיר מולקולות מאוגד. באשר לדרישות זמן ELISA הם הרבה יותר (~ שעות 16-18) לניתוח מדגם אחד. יש צורך בזמן דגירה ארוך יותר כמו הרגישות של assay מוגבר במיוחד למחקר זה, כמוקד היה להשוות את הגבול התחתון של זיהוי.
הבחירה של כימיה של פני השטח תשתנה מיישום אחד להמשנה וזה יכול להתממש כאחד מההגבלה של טכניקת SPRi. במחקר זה, מגוון ושילוב של linkers הכימי ומולקולות חסימה רחבים הוערכו על מנת להשיג את השילוב הנכון כדי לצפות יעילות מחייבת אופטימלית של rhGH אל פני השטח החיישן. לדוגמא, במחקר זה, שילוב של BSA וPEG שימש גם במזעור אינטראקציות שאינן ספציפיות. עם זאת, במחקר קודם 17, שבו ליגנד הלכידה היה aptamers, PEG שימש לבד כמולקולת החסימה הטובה ביותר. המשתניםשהיעילות להשפיע מחייבת של אנליטי ליגנד תלויה גם ברמת חומציות, חיץ וטמפרטורה. לכן, עם כל יישום, משתנה אלה צריכים להיות מותאמים. בנוסף, זה קריטי כדי לקבוע את ריכוז תצפית האופטימלי של יגנד אל פני השטח השבב. ניסוי טיטרציה עם מגוון רחב של ריכוזים של ligands המשותק מתבצע לפני ביצוע המחקר. באשר לELISA, שלב מכריע בהליך היה למזוג חיץ לשטוף מבארות על ידי הקשה על microplate כמו זה הבטיח לא נוזלי שיורית הוא שאריות. הסרת לשטוף החיץ עם פיפטה לא הייתה מספיק כמו כל נוזל שיורית הפריע לקריאת האות של מדגם היעד.
בהתייחסות לרגישות, ELISA (/ מיליליטר ng 1) דומה לSPRi (3.61 ng / ml) אבל ננו-SPRi (9.20 pg / ml) משפר את הרגישות על ידי שלושה סדרי גודל, ובכך מאפשר מדידות ברמות הביולוגיות נמוכות יותר של rhGH 0.03 ng / ml. כפי שדיווחנו בעבר 16,17, שיפור האות הנחילה ידי NanoEnhancers מיוחס להשפעה טעינה המונית והצימוד החזק שקיים בין fluorophores ניר וplasmons משטח הפצת עבור ננו סרט זהב. למרות ש, ננו-SPRi מוסיף צעד נוסף להליך, זה ברמה של רגישות יכולה להרחיב את היישומים של טכנולוגית SPRi בשקעים שונים.
SPRi מספק למדענים פרופיל הקינטית מלא (K D, K ו- D K) של נוגדן / אינטראקציה rhGH אילו ELISA יכול לדווח ערכי זיקה בלבד. מקדם שונה (CV) היה מתחת ל -10% לSPRi (4.1%) וELISA (6.5%), המצביע על שחזור טוב. ערכי זיקת ELISA וSPRi שונים בגלל נוגדני הלכידה משותקים על שבב החיישן שונים מנוגדנים המשותקים בצלחת 96-היטב ELISA. באשר לננו-SPRi ערך גבוה יותר קורות חיים (20%) נצפה. ישנם מספר פרמטרים שיכולים לתרום כמקור ErroRS לקביעת קורות חיים. לדוגמא, עם ניסוי ננו-SPRi ריכוז נמוך בהרבה של אנליטי שנמדד, התוספת של NanoEnhancers מוסיפה שלב נוסף בהליך והניסוי בוצע באופן ידני. מתאם טוב מאוד בין ננו-SPRi וELISA הושג לצורך זיהוי של rhGh בסרום אנושי ממוסמר. לבסוף, ELISA יכול להיות טכניקה אמינה עם זאת השיטה עצמה היא לצרוך זמן שהופך אותו קשה לשימוש במצבים הדורשים ניטור בזמן אמת וריבוב, כפי שהוא במקרה של HGH. בנוסף, תכונה אטרקטיבית יותר שלא נחקרה באופן ישיר במחקר זה שSPRi מציע מעל ELISA, היא היכולת למדוד מאות אינטראקציות בו זמנית בזמן אמת. לכן בעתיד, שיטת ננו-SPRi תוערך כדי לזהות סמנים ביולוגיים מרובים בו זמנית בזמן אמת (ריבוב) נוכחים בסרום בריכוזים שונים על מנת לבחון את הפוטנציאל שלה ככלי לאבחון קליני ובת קיימא.
The authors have nothing to disclose.
NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.
Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
Nanostrip | Cyantek | ||
N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
SPR biochip | HORIBA | ||
SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |