Genome-wide Kartlegging av narkotika DNA Interactions i Cells med COSMIC (Fornetting av små molekyler å isolere Chromatin)

Summary

Identifisere de direkte målene for genom målretting molekyler er fortsatt en stor utfordring. For å forstå hvordan DNA-bindende molekyler engasjere genomet, har vi utviklet en metode som er avhengig av kryssbinding av små molekyler å isolere kromatin (COSMIC).

Abstract

Genomet er målet for noen av de mest effektive kjemoterapeutiske midler, men de fleste av disse stoffene mangler DNA-sekvens spesifisitet, noe som fører til dosebegrensende toksisitet, og mange uønskede bivirkninger. Målretting genomet med sekvensspesifikke små molekyler kan gjøre det mulig molekyler med økt terapeutisk indeks og færre off-target effekter. N -methylpyrrole / N metylimidazol polyamider er molekyler som kan rasjonelt utformet for å målrette spesifikke DNA-sekvenser med utsøkt presisjon. Og i motsetning til de fleste naturlige transkripsjonsfaktorer, kan polyamider binde til metylert og chromatinized DNA uten tap i affinitet. Sekvensen spesifisiteten av polyamider er blitt grundig undersøkt in vitro med beslektet område identifikasjon (CSI) og med tradisjonelle biokjemiske og biofysiske nærmer seg, men studiet av polyamid binding til genomiske mål i cellene fortsatt ukjent. Her kan vi rapportere en fremgangsmåte til tverrbinding av små molekyler isolate kromatin (COSMIC), som identifiserer polyamid bindingssteder over hele genomet. COSMIC er lik kromatin immunoutfelling (chip), men skiller seg i to viktige måter: (1) en photocrosslinker anvendes for å muliggjøre selektiv, midlertidig styrt innfanging av polyamid bindende hendelser, og (2) biotin affinitet håndtaket benyttes til å rense polyamid -DNA-konjugater i henhold til semi-denaturerende betingelser for å redusere DNA som er ikke-kovalent bundet. COSMIC er en generell strategi som kan brukes for å avsløre genombindingsbegivenheter av polyamider og andre genom-målretting kjemoterapeutiske midler.

Introduction

Den informasjon for å gjøre hver celle i kroppen er kodet i DNA. Den selektive bruk av denne informasjonen styrer skjebnen til en celle. Transkripsjonsfaktorer (TFS) er proteiner som binder seg til spesifikke DNA-sekvenser for å uttrykke en bestemt undergruppe av gener i genomet, og funksjonsfeil i TFS er knyttet til starten av en lang rekke sykdommer, inkludert utviklingsdefekter, kreft og diabetes . ^1,2 Vi har vært interessert i å utvikle molekyler som selektivt kan binde til genomet og modulerer gen regulatoriske nettverk.

Polyamider består av N -methylpyrrole og N metylimidazol er rasjonelt utformet molekyler som kan målrette DNA med særegenheter og slektskap som rivaliserende naturtranskripsjonsfaktorer. ^3-6 Disse molekylene binder seg til spesifikke sekvenser i mindre sporet av DNA. ^{4,5,7 -11} Polyamider har vært ansatt både undertrykke og aktivere uttrykk for spesifikke gEnes. ^4,12-19 De har også interessante antivirale ^{20-24 og} kreft ^12,13,25-30 egenskaper. En attraktiv funksjon av polyamider er deres evne til å få tilgang til DNA-sekvenser som er metylert ^31,32 og pakket rundt histonproteiner ^9,10,33.

For å måle de omfattende bindingsspesifisiteter av DNA-bindende molekyler, vårt laboratorium opprettet beslektet område identifikator (CSI) -metoden. ^34-39 Den antatte forekomsten av bindingsseter basert på in vitro-spesifisiteter (genomescapes) kan vises på genomet, fordi in vitro bindende intensiteter er direkte proporsjonal med foreningen konstanter (K _a). ^34,35,37 Disse genomescapes gi innsikt i polyamid belegg over genomet, men måle polyamid bindende i levende celler har vært en utfordring. DNA er tett pakket i kjernen, noe som kan påvirke tilgjengeligheten av bindingssteder. Accessibility av disse chromatinized DNA-sekvenser til polyamider forblir et mysterium.

Nylig, til mange metoder studere samspillet mellom små molekyler og nukleinsyrer har dukket opp. ^40-48 Den affinitet fangst og massivt-parallell DNA-sekvensering (chem-seq) er en slik teknikk. Chem-seq bruker formaldehyd for å kryssbinde små molekyler til et genomisk mål av interesse og et biotinylert derivat av et lite molekyl av interesse å fange ligand-target-interaksjon. ^48,49

Formaldehyd kryssbinding fører til indirekte vekselvirkninger som kan produsere falske positiver. ⁵⁰ Vi har utviklet en ny metode, kryssbindingen av små molekyler å isolere kromatin (COSMIC), ^{51 med} en photocrosslinker å eliminere disse såkalte "fantom" topper. ⁵⁰ til å begynne, vi designet og syntetisert trifunksjonelle derivater av polyamider. Disse molekylene inneholdt et DNA-bindende polyamide, en photocrosslinker (psoralen), og en tilhørighet håndtaket (biotin, figur 1). Med trifunksjonelle polyamider, kan vi kovalent fange polyamid-DNA-interaksjoner med 365 nm UV-bestråling, en bølgelengde som ikke skader DNA eller indusere ikke-psoralen-baserte tverrbinding. ⁵¹ Deretter vi fragmentere genomet og rense det oppfangede DNA under strenge, semi -denaturing betingelser for å redusere DNA som er ikke-kovalent bundet. Således ser vi på kosmiske som en metode relatert til chem-seq, men med en mer direkte avlesning av DNA målretting. Viktigere, svak (K ₁₀ ³ -10 ⁴ M ^-1) psoralen affinitet for DNA ikke påviselig effekt polyamid spesifisitet. ^51,52 anriket DNA-fragmenter kan analyseres enten ved kvantitativ polymerasekjedereaksjon ⁵¹ (kosmiske-qPCR) eller ved neste generasjons sekvense ⁵³ (COSMIC-seq). Disse data aktivere en objektiv, genom styrt design av ligander som interopptre med sine ønskede genomisk loci og minimere off-target effekter.

Figur 1. Bioaktive polyamider og COSMIC ordningen. (A) hårnål polyamider 1 – 2 målet DNA-sekvensen 5'-WACGTW-3 '. Lineære polyamider med 3 – 4 mål 5'-AAGAAGAAG-3 '. Ringer av N-methylimidazole er uthevet for klarhet. Åpne og fylte sirklene representerer N -methylpyrrole og N metylimidazol hhv. Square representerer tre-klortiofen og diamanter representerer β-alanin. Psoralen og biotin er betegnet med P og B, respektivt. (B) COSMIC ordningen. Celler behandles med trifunksjonelle derivater av polyamider. Etter kryssbinding med 365 nm UV-bestråling, cellene er lysed og genomisk DNA er skåret. Streptavidin-belagte magnetiske kuler blir tilsatt for å fange opp polyamid-DNA-addukter. DNA frigjøres og kan analyseres ved kvantitativ PCR (qPCR) eller ved neste generasjons sekvensering (NGS). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. Fornetting i levende celler Begynn med ~ 2.5×10 7 H1 celler, eller andre dyrkede celler. MERK: Dette nummeret av H1 celler tilsvarer fem 10-cm retter (ca. 40% konfluens). Grow celler i E8 media på retter belagt på en overflate som støtter pluripotente stamceller (se Materials List), og inkuber dem ved 37 ° C i fuktig atmosfære med 5% CO 2. Høste celler enzymatisk (se Materials List). Merk: Ikke la H1 celler til å overstige 90% confluency; confluency induserer s…

Representative Results

Å ta hensyn til ikke-uniform genom fragmentering og andre variabler, bør den rensede DNA alltid være normalisert mot en referanse av Input DNA. Primere som er spesifikke for et locus av interesse kan benyttes. Det er også nyttig å analysere et locus hvor molekylet ikke forventes å binde, som en negativ kontroll. Vi ser en> 100 ganger økning i polyamid belegg ved bestråling med 365-nm lys (figur 2). Anriket DNA kan også analyseres ved neste generasjons sekvenserin…

Discussion

One of the primary challenges with conventional ChIP is the identification of suitable antibodies. ChIP depends heavily upon the quality of the antibody, and most commercial antibodies are unacceptable for ChIP. In fact, the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) consortium found only 20% of commercial antibodies to be suitable for ChIP assays.⁵⁰ With COSMIC, antibodies are replaced by streptavidin. Because polyamides are functionalized with biotin, streptavidin is used in place of an antibody to capture polyam…

Materials

Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	any source
Benzamidine	any source
Pepstatin	any source
Proteinase K	any source
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies	65001
PBS, pH 7.4	Life Technologies	10010-023	Other sources can be used
StemPro® Accutase® Cell Dissociation Reagent	Life Technologies	A1110501
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	We have tried other manufacturers of DNA columns with success.
TruSeq ChIP Sample Prep Kit	Illumina	IP-202-1012	This Kit can be used to prepare COSMIC DNA for next-generation sequencing
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD Biosciences	356231	Used to coat plates in order to grow H1 ESCs
pH paper	any source
amber microcentrifuge tubes	any source
microcentrifuge tubes	any source
pyrex filter	any source		Pyrex baking dishes are suitable
qPCR master mix	any source
RNase	any source
HCl (6 N)	any source
10-cm tissue culture dishes	any source
Serological pipettes	any source
Pasteur pipettes	any source
Pipette tips	any source
15-mL conical tubes	any source
centrifuge	any source
microcentrifuge	any source
nutator	any source
Magnetic separation rack	any source
UV source	CalSun	B001BH0A1A	Other UV sources can be used, but crosslinking time must be optimized empirically
Misonix Sonicator	Qsonica	S4000 with 431C1 cup horn	Other sonicators can be used, but sonication conditions must be optimized empirically
Humidified CO2 incubator	any source
Biological safety cabinet with vacuum outlet	any source