في وقت واحد ثنائي الفوتون<em> في فيفو</em> تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال
Summary
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Abstract
This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex.
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.
Introduction
ثورة ثنائي الفوتون المجهري مراقبة نشاط الدماغ في العيش والتصرف الحيوانات. منذ إطلاقها في عام 1990 وسرعان ما اكتسب شعبية ويتم تنفيذه الآن واحدة من الطرق الأكثر إثارة للاهتمام ومبتكرة من أجل النظر في جوانب عديدة من نشاط الدماغ في الجسم الحي 1،2. وتشمل هذه التطبيقات قياس تدفق الدم، وتنشيط الخلايا العصبية (على سبيل المثال، وذلك باستخدام مؤشرات مستوى الكالسيوم أو الجينات في وقت مبكر فورية التعبير) ومورفولوجيا الخلايا العصبية. عدد متزايد من المختبرات استخدام المجهر ثنائي الفوتون، وتنفيذ تقنية في جميع أنحاء العالم العلمي كمعيار جديد للتصوير في الجسم الحي الدماغ.
ينطوي على نهج موحد زرع نافذة في الجمجمة (حفرة مستديرة في الجمجمة مغطاة غطاء زجاجي) على برميل أو القشرة البصرية في الدماغ الماوس 3. المقبل، اعتمادا على بروتوكول التجريبية، ومذكرة التفاهمحد ذاته يخضع لسلسلة من التصور والدورات التدريبية السلوكية، مما يسمح لرصد التغيرات في نشاط الدماغ ومورفولوجيا الخلايا العصبية على مر الزمن 4،5. في كلتا الحالتين يؤثر على حج القحف فقط العظم الجداري، دون عبور الغرز. ويعتقد إلى حد كبير أن العيب الرئيسي لهذه التقنية هو التطبيق المحدود لاللحاء يمكن الوصول إليها بسهولة مثل برميل أو القشرة البصرية. زرع نافذة في الجمجمة على مناطق أخرى يطرح الكثير من الصعوبات، بسبب النزيف و / أو إعاقة المكاني.
في هذه الورقة نقترح زرع نافذة في الجمجمة فوق قشرة خلف الطحال (RSC)، ومنطقة أخرى ممكنة من الفائدة لمدة الفوتون في الجسم الحي المجهري 6. RSC هو عنصر هام من الدائرة الدماغ المسؤولة عن تكوين الذاكرة المكانية. تشريحيا، RSC هو جزء من شبكة الخلايا العصبية التي تربط القشرية، الحصين، والمناطق مهادي 7. أنهشارك بقوة في مجموعة من السلوكيات، مثل التعلم المكاني والانقراض وكذلك الملاحة الفضائية 6.
من أجل تصور التغيرات المورفولوجية من الخلايا العصبية التي نستخدمها خط الماوس المعدلة وراثيا التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت المروج thy1. في هذه الفئران، ويتم التعبير عن GFP في ما يقرب من 10٪ من الخلايا العصبية في الدماغ مما يسمح لتصور واضح للمحاور القشرية والتشعبات باستخدام اثنين من الفوتون المجهري 8. آخر الابتكارات التي نقترحها هي حقن المؤتلف الغدة المرتبطة المصلي فيروس 2/1 (rAAV2 / 1) الترميز بروتين أحمر فلوري (mCherry) تحت الخلايا العصبية المحددة كمكي المروج 9 في هياكل العميقة من الدماغ إسقاط لRSC ، مثل الحصين. التعبير عن rAAV2 / 1 mCherry في حصين الماوس Thy1-GFP يسمح لتصور في وقت واحد من العناصر قبل وبعد المشبكي من hippocampo-corticaل نقاط الاشتباك العصبي 10. التعبير مدفوعة rAAV من mCherry يتطلب 2-3 أسابيع للبروتين لتصل إلى مستوى كاف في محطات محور عصبي. هذه الفترة هي متسقة مع الوقت المعتاد المطلوبة للانتعاش من حج القحف.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة نقدم بروتوكول لفي وقت واحد ثنائي الفوتون في التصوير المجراة من مدخلات متشابك والأهداف بعد المشبكي في RSC من خلال نافذة في الجمجمة. تتكون إجراء زرع عدة خطوات رئيسية. أولا، هذا الحيوان هو تخدير عميق وثابت في إطار المجسم، ومن ثم ضعفت الجمجمة على RSC ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر السيد Steczkowski لتسجيلات صوتية، M. Borczyk للرسومات، A. Trąbczyńska لإنتاج الفيروس، M. Ziókowska عن التنميط الجيني وA. Mirgos للحصول على المساعدة مع التصوير. KR يعترف هدية النوع من الفيروس المؤتلف الغدة المرتبطة (rAAV) التعبير عن بروتين فلوري mCherry تحت سيطرة المروج CaMK من K. Deisseroth. تم تنفيذ هذا المشروع في المرافق الأساسية من مختبر النماذج الحيوانية ومختبر بنية الأنسجة وظيفة، مركز علم الأعصاب، معهد نينكي علم الأحياء التجريبي، مع استخدام البنية التحتية CEPT بتمويل من الاتحاد الأوروبي – صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي في البرنامج التشغيلي "المبتكرة الاقتصاد" للفترة 2007-2013. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المركز الوطني للعلوم: سوناتا مكرر 2012/05 / E / NZ4 / 02996، هارمونيا 2013/08 / M / NZ3 / 00861، Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 لKR وسوناتا مكرر 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 لRC
Materials
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
