Phosphoinositides는 상대적인 풍부 빠르게 다양한 자극에 대한 반응의 변화 지질 신호된다. 이 문서 추출 및 탈아 실화 다음 3 H-의 미오의 -inositol와 대사 라벨 세포에 의해 phosphoinositides의 풍부를 측정하는 방법을 설명합니다. 추출 글리세 inositides 후 고성능 액체 크로마토 그래피로 분리하고, 섬광 유동에 의해 정량화된다.
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방법 논문
고성능 액체 크로마토 그래피 결합 흐름 섬광에 의한 방사성 표지 및 Phosphoinositides의 세포 수준의 정량화
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
Phosphoinositides (PtdInsPs)는 특정 effector를 모집하고 분자 정체성과 기능을 가진 소기관을 부여하는 필수 신호 지질입니다. 7개의 PtdInsP는 각각 분포와 풍부도가 다르며, 이는 특정 키나아제와 인산가수분해효소에 의해 엄격하게 조절됩니다. PtdInsP의 풍부함은 다양한 신호 전달 이벤트 또는 조절 메커니즘의 교란에 대응하여 갑자기 변할 수 있습니다. 이러한 이벤트가 PtdInsP의 양과 그에 따른 영향의 변화로 이어지는 방법을 이해하려면 신호 이벤트 전후 또는 제어 상태와 비정상 상태 사이의 PtdInsP 수준을 정량화하는 것이 중요합니다. 그러나 풍부도와 유사성이 낮기 때문에 각 PtdInsP의 상대적인 양을 정량화하는 것은 어려울 수 있습니다. 이 논문은 PtdInsPs에 통합된 3H-myo-inositol로 세포를 대사적으로 표지하여 PtdInsP 수준을 정량화하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 인지질이 침전되고 탈아실화됩니다. 생성된 용해성 3H-글리세로 이노시티드를 추가로 추출하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분리하고 유동 섬광으로 검출합니다. 효모 샘플의 라벨링 및 처리는 물론 HPLC 및 유동 신틸레이터의 기기 설정에 대해 자세히 설명되어 있습니다. 아실 사슬 함량에 대한 구조적 정보가 손실되었음에도 불구하고 이 방법은 민감하며 세포에서 7개의 PtdInsP를 모두 동시에 정량화하도록 최적화할 수 있습니다.
서론
Phosphoinositides (PtdInsPs)는 신호 전달, 막 수송 및 유전자 발현을 포함한 다양한 세포 기능을 조절하는 데 도움이 되는 중요한 신호 인지질이며, 이는 세포 분열, 세포 기관 정체성 및 대사 활동과 같은 고차 세포 행동을 조절합니다1-3. PtdInsP에는 모 인지질인 포스파티딜이노시톨(PtdIns)의 이노시톨 머리 그룹의 3, 4 및/또는 5개 위치의 인산화에서 파생된 7가지 종류가 있습니다. 중요한 것은 7개의 PtdInsP가 불균등하게 분포되어 있고 각 PtdInsP 종의 국소 농도는 특정 세포 내 부위에서 증가하거나 감소할 수 있으며, 여기서 이들은 별개의 단백질 효과기 세트에 결합하여 각 PtdInsP가 숙주 막의 정체성과 기능을 제어할 수 있도록 합니다3,4. 또한 PtdInsP에 의해 생성된 신호 강도에 큰 영향을 줄 수 있으므로 각 PtdInsP의 수준을 엄격하게 제어해야 합니다. 각 PtdInsP의 국소화 및 수준은 각 PtdInsP의 합성 및 회전을 매개하는 수많은 지질 키나아제, 인산가수분해효소 및 인산리파제의 표적화 및 활성에 따라 달라집니다3,4. 따라서 PtdInsP 조절 기전의 잘못된 조절은 세포 기능을 교란시켜 암 및 퇴행성 질환과 같은 질병을 유발할 수 있습니다2,5,6<....
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프로토콜
주 : 텍스트가 아래에서 상세히 효모 PtdInsPs을 측정하는 방법을 설명한다. 이 라벨 효모 3 H-의 미오의 -inositol와 세포 추출 및 deacylating 지질과 분별과 탈아 실화 PtdInsPs을 정량화 할 수있는 HPLC-용출 프로토콜에 대한 실험 세부 정보를 제공합니다. 최적화 및 이상 HPLC-용출 프로파일을 요구하는 포유 동물 세포에서 PtdInsPs의 라벨, 탈아 실화, 해상도 및 정량을 유의하시기 바랍니다. 우리가 토론에서 측면의 일부를 설명하지만이 정보는 다른 곳에서 찾아 볼 수있다. 전반적으로, 방법은 지질, deacylate를 추출 효모가 주어진 그림 1에 도시에서 수용성 촉진제-InsPs를 추출합니다.
효모의 레이블과을 분석 PtdInsPs 1. 프로토콜
- 세포 배양 및 방사성 표지
- 상수가 완료 합성에서 진탕하면서 30 ℃에서 효모 균주 SEY6210 20 ㎖의 배양액을 성장미드 로그 상 또는 약 600 nm의 0.6-0.7 (OD 600)에서의 광학 밀도 매체.
참고 :이 3 H-미오 -inositol 통합에....
- 상수가 완료 합성에서 진탕하면서 30 ℃에서 효모 균주 SEY6210 20 ㎖의 배양액을 성장미드 로그 상 또는 약 600 nm의 0.6-0.7 (OD 600)에서의 광학 밀도 매체.
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결과
이 방법을 사용, 효모 PtdInsPs는 대사 3 H-의 미오의 -inositol으로 표시했다. 표지 후, 인지질 및 인지질 탈아 실화 수용성 촉진제-InsPs (도 1)의 추출하여, 과염소산로 침전시켰다. 이 단계에서, 그것은 PtdIns 같은 매우 미량 PtdInsPs에 충분한 신호 대 잡음비를 보장하기 위해 액체 섬광에 의해 추출 촉진제-InsPs와 관련된 총 방사능 신호를 정량화하는 것이 중요하다 (3,5) P (2); 5-10000000 CPM이 총 분사한다. 효모 세포에만 네 PtdInsPs을 나타내고 있기 때문에 (도 2) 한 바와 같이, 해상도가 1 시간 용출 방법으로 달성 될 수있다.
Δ 및 vac14의 Δ 효모 .......
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토론
이 문서에서는 효모에서 HPLC 결합 흐름 섬광에 의해 PtdnsPs의 세포 수준을 정량화하는 데 필요한 실험 프로토콜을 자세히 설명합니다. 방법론은 지질 처리 및 수용성 H-3-InsPs 촉진제, HPLC 분획의 추출 및 분석 하였다 3 H-의 미오의 -inositol와 PtdInsPs의 대사 라벨링을 가능하게한다. PtdIns (3,5) 야생형, vac14 D와 atg18의 D 효모 세포 (그림 4)에서 P 2 도시 된 바와 같이이 방법을 사용하여, 다양한 조건 하에서 세포에서 PtdInsPs의 상대적 수준은 정량화 할 수있다.
결과를 최적화 및 / 또는 문제를 해결하기 위해 수행 될 수있는 중요한 단계 및 변형들이있다. PtdInsPs 신뢰성 정량을 달성하기위한 가장 중요한 파라미터 중 하나는 총 방사능 신호 레벨이다. 일반적으로 HP.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
C.Y.H.는 온타리오 주 정부의 온타리오 대학원 장학금의 지원을 받았습니다. 이 기사는 R.J.B.가 Natural Sciences and Engineering Research Council, Canada Research Chairs Program 및 Ryerson University의 자금 지원을 받아 작성되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1-부탄올 | 바이오 베이직 | BC1800 | 시약 등급 |
| 인산 암모늄 이염 기성 | Bioshop | APD001 | ACS 등급 |
| 황산 암모늄 | 바이오 염기성 | ADB0060 | 울트라 퓨어 급 |
| 자동 샘플러 | 애질런트 | G1329B | 애질런트 1260 인피니티 시리즈 |
| 비오틴 | 시그마 | B4501 | |
| 붕산 | 생물 염기성 | BB0044 | 분자 생물학 학년 |
| 염화 칼슘 | 생물 염기성 | CT1330 | 무수, 산업 학년 |
| 판토텐산 칼슘 | 시그마 | C8731 | |
| 구리 (II) 황산염 | 시그마 | 451657 | 무수 |
| D-포도 | 생물 염기성 | GB0219 | 무수, 생명 공학 학년 |
| Dulbecco의 변형 Eagle's Medium | Life | 11995-065 | 4.5 g/L 포도당, 110 mg/L pyruate, L-글루타민 |
| Dulbecco의 Eagle's Medium | MP biomedicals | 변형 0916429 | 4.5 g/L 포도당으로, L-글루아트민 없이, 이노시톨 없이 |
| EDTA | Biobasic | EB0107 | 무산, 초순수 등급 |
| 에틸 에테르 | Caledon labs | 1/10/4700 | 무수, 시약 등급 |
| 포름산 에 | 틸 시그마 | 112682 | 시약 등급 |
| 소 태아 혈청 | Wisent | 080-450 | US 원산지, 프리미엄 품질, 열 비활성화 |
| 소 태아 혈청, 투석 | 생활 | 26400044 | 미국 원산지 |
| FlowLogic U | LabLogic Systems Ltd | SG-BXX-05 | 플로우 섬광용 섬광 유체 |
| 엽산 | 생물 염기성 | FB0466 | USP 등급 |
| HEPES 완충 용액 | Life | 15630080 1 M 용액 | |
| 이노시톨, Myo-[2-3H(N)] | Perkin Elmer | NET114005MC | 9:1 에탄올 to water |
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄-에탄올아민 | Life | 51500056 | 100x 용액 |
| Iron(III) chloride | Sigma | 157740 | 시약 |
| grade Laura - 크로마토그래피 데이터 수집 및 분석 소프트웨어 | LabLogic Systems Ltd | 버전 4.2.1.18 | 플로우 신틸레이터 소프트웨어 |
| L-글루타민 | 시그마 | G7513 | 200 mM, 용액, 멸균 여과, BioXtra, 세포 배양에 적합 |
| 염화마그네슘 | 시그마 | M8266 | 무수 |
| 황산 망간 | 생물 염기성 | MB0334 | 일수화물, ACS 등급 |
| 메탄올 | Caledon labs | 6701-7-40 | HPLC 등급 |
| 메틸 아민 용액 | 시그마 | 426466 | 40 % (v / v) |
| 인산 | 일 칼륨바이오베이직 | PB0445 | 무수, ACS 등급 |
| 니코틴산 | 바이오베이직 | NB0660 | 시약 등급 |
| OpenLAB CSD ChemStation | 애질런트 | 개정판 C.01.03 | HPLC 소프트웨어 |
| p-aminobenzoic acid (PABA) | Bioshop | PAB001.100 | Free acid |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | 100X, 액체, 안정화, 멸균 여과, 세포 배양 테스트 |
| 과염소산 | Sigma | 244252 | ACS 시약, 70 % |
| PhenoSpher SAX 컬럼 | Phenomenex | 00G-315-E0 | 5 µ m, 80 Å, 250 x 4.6 mm |
| 인산 | Caledon labs | 1/29/8425 | 시약 등급 |
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| 요오드화 칼륨 | 생물 염기성 | PB0443 | ACS 등급 |
| 피리독신 염산염 | 시그마 | P9755 | |
| Quaternary 펌프 | 애질런트 | G1311C | 애질런트 1260 인피니티 시리즈 |
| 리보플라빈 | Bioshop | RIB333.100 | USP 등급 |
| 염화나트륨 | 생물 염기성 | DB0483 | 생명 공학 등급 |
| 몰리브덴산 나트륨 | 시그마 | 243655 | |
| 온도 조절 컬럼 구획 | 애질런트 | G1316A | 애질런트 1260 인피니티 시리즈 |
| 티아민 염산염 | 시그마 | T4625 | 시약 등급; 0.02%(W/V)의 용액을 만들고 현탁액을 형성합니다. 혼합 및 동결 분취 |
| Ultima Gold | Perkin Elmer | 6013321 | Scintillation coctail for liquid scintillation counting |
| Zinc sulfate | Biobasic | ZB2906 | Heptahydrate, 시약 grade |
| β-RAM 4 | IN/US 시스템 | 모델 4 | Flow scintillator - 500 µ l 플로우 셀; Perkin Elmer의 대체 방사선 흐름 신틸레이터 분석기 |
참고문헌
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Bridges, D., Saltiel, A. R. Phosphoinositides and Disease. Curr. Top. Microbiol. Immuno. 362, 61-85 (2012).
- Botelho, R. J.
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