This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.
The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.
Utveksling av næringsstoffer, gasser og avfallsprodukter i løpet eutherian svangerskap er mediert av morkaken. I den kvinnelige skjede, livmor arterier er de viktigste rørledninger av blod til livmoren. Etter implantasjon, disse gren inn i spesialiserte fartøy kalt spiralarteriene at spolen gjennom decidua basalis mot fetoplacental enhet. Diameter og elastisitet av disse spiralarteriene, som er omgitt av leukocytter, spesielt uterin natural killer (unk) celler, diktere volumet og hastigheten av blod tilgjengelig for placenta 1,2. Riktig hemodynamiske endringer som følge av ombygging av spiralarteriene er avgjørende for graviditet suksess.
Mens de underliggende mekanismene varierer i detalj mellom menneske og mus graviditet, det endelige resultatet av ombyggingen prosessen i begge artene er utvidet, høy ledningsevne blodkar som mister sin glatt muskulatur lag. I mus, unk celle-avledet interferon (IFN-) γ er nødvendig for å indusere disse endringene på rundt midten av svangerskapet 3-5. Mus som mangler enten NK-celler eller komponenter av IFN-γ signalveien ikke klarer å gjennomgå slike endringer, og dette er forbundet med redusert føtal vekst 6,7, hvilket understreker viktigheten av en adekvat blodtilførsel til fetoplacental enheten. Under tidlig graviditet, interstitiell og endovaskulær invasjon av extravillous trophoblast og deres samspill med Unk cellene er viktig for å indusere vaskulære forandringer og fremme fostervekst 8-10. unk celler kan organisere human trophoblast invasjon gjennom kjemokiner 11 og cytokiner så som granulocytt-makrofag – kolonistimulerende faktor (GM-CSF) 12. Shallow trophoblast invasjonen er assosiert med redusert arteriell ombygging og svangerskapskomplikasjoner som svangerskapsforgiftning 9.
Denne protokollen er basert på den banebrytende arbeidet til Anne Croy som beskrev den viktigerolle i immunsystemet og spesielt NK-avledet IFN-γ for vellykket vaskulær remodellering gjennom immunhistokjemi og elegant overføringseksperimenter 5,13. Her beskriver vi en rask og økonomisk måte å vurdere ombygging status av spiralarteriene. Selv om vår lab vurderer dette rutinemessig på midten av svangerskapet (drektighets dag (gd) 9,5) 14, tar ombygging prosessen sted mellom gd8.5 og 12,5 15. Ankomsten av automatiserte lysbilde skannere har i stor grad vurderingen av fartøyet og lumen områder fra seksjoner og vi fant dette å være en mer reproduserbar tilnærming enn å måle fartøyet diameter. Tilsetning av immunhistokjemisk påvisning av SMA åpner for en grei validering av resultatene oppnådd fra stereological vurdering. Som med alle stereological teknikker, anbefales det å utføre vurderingen som en blindet forsøk med minst to sensorer. For å oppnå dette, kan en randomisering trinn innføres når serielt kutteskaps prøvene slik at etterforskerne vurderer lysbildene ikke vet hvorfra eksperimentelle gruppen prøvene kommer.
Det overordnede målet med denne protokollen er å gi et pålitelig verktøy for å vurdere nøye ombygging av spiralarteriene hos mus med definerte mors og fars genotyper, i sammenheng med musemodeller for svangerskapsrelaterte komplikasjoner. Resultatene streker avhengighet unk celler av denne prosessen, som er avgjørende for normal fostervekst.
Protokollen som presenteres her er utformet for å tilveiebringe en reproduserbar metode for å vurdere de vaskulære endringer som er nødvendig for vellykket svangerskap. Kritisk for å lykkes med denne evalueringen er kvaliteten på vevssnitt. Både nøyaktig bestemme gestasjonsalder av implantasjoner samt pålitelig ligere livmor arterier er avgjørende skritt. Endringer i parametere som tid for fiksering, vev-behandlingsprotokoll, etc., kan også påvirke resultatet. For en objektiv vurdering stereological, er det viktig å måle det samme antall fartøy i hvert implantasjonsstedet. Det anbefales å måle 5 skip per implantasjonsstedet og hver implantasjonsstedet i tre eksemplarer. Gjennomsnittet av disse 15 målingene representerer den midlere størrelse av de 5 største skipene.
Videre til data fra alymphoid Rag2 – / – IL2rg – / – mus vist her, fant vi denne protocol nyttig for en rekke modeller av utilstrekkelig mors immunforsvar, deriblant en av hemmet NK-celler 14. Defekter i arteriell ombygging har også vært vist i modeller av svekket trophoblast invasjon 18 og teknikkene som er beskrevet her kan være nyttig for å vurdere blodkar i disse tilfellene. Vi optimalisert og validert denne protokollen for undersøkelse av decidual vaskulær remodellering ved midten av svangerskapet hos mus, men det er også tenkelig å tilpasse denne protokollen til å arbeide i andre modellsystemer (f.eks rotter) eller i andre organer. Mens vi finner at NK-avhengige ombygging kan robust vurderes til gd9.5, kan det endres for andre tidspunkter som gd12.5, når morens blodkar er fullstendig ombygd. På dette tidspunkt, er endovaskulær trophoblast invasjon dypere og 16 dette tidspunkt kan være mer egnet for undersøkelser av rollen som trophoblast for vaskulære endringer. Hvis ytterligere kvantitative avlesninger er ønsket,søkere kan også øke antallet seksjoner farget for SMA og vurdere den prosentandel av delvis ombygde skip innen hvert implantasjonsstedet.
En begrensning av denne protokollen er beskrivende natur histologiske undersøkelser. Funksjonelle analyser, men er bare langsomt blir tilgjengelig (slik som Doppler ultralyd 19). Disse teknikkene krever teknisk kompetanse og mye høyere utgifter til anskaffelse og vedlikehold av utstyr, men har fordelen av å gi en langsgående in vivo avlesning for effekten av endringene som kan observeres histologisk. En mulig ulempe med alle stereological eksamener er subjektivitet etterforskerne. For å oppnå dette, kan ved hjelp av to uavhengige sensorer som analyserer alle prøver uavhengig bidra til å unngå dette problemet. Mens protokollen skissert her gir innsikt i hvor mye blod kan nå fetomaternal grensesnittet, kan det være en fordel å kombinere det med komplementary tilnærming for å vurdere den totale mengden av blod til enhver tid i blodkar gjennom plast kaster 16.
Styrken i denne protokollen er at den kombinerer to uavhengige tilnærminger. Vaskulær endringen er først kvantitativt vurdert av stereology og resultatet blir deretter validert kvalitativt hjelp immunhistokjemi. Påliteligheten av resultatene kan bli ytterligere styrket ved randomisering prøvene. Prøvene forberedt for denne protokollen kan lett brukes til å også undersøke andre parametere av svangerskapet som decidualisation, utvikling av mesometrial lymfoid summen av svangerskapet (MLAp) eller immundeteksjon av celler av interesse, å strengt vurdere en graviditet fenotype ved midgestation.
Arteriell ombygging er et kritisk punkt for ukompliserte svangerskap hos kvinner og unnlatelse av disse endringene underbygger de store fødselssyndromer (GOS), nemlig svangerskapsforgiftning, begrensning fostervekst ogdødfødsel. Vi presenterer her teknikker for å nøye vurdere en graviditet fenotype i musemodeller som etterligner noen av egenskapene til patofysiologien ved GOS.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.
C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
Dental floss | |||
Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
25G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
Microtome | Leica | RM2245 | |
Slide rack | Sigma | Z710989 | |
Coplin jar | Sigma | S5891 | |
Purified water | |||
Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
Fume hood | |||
Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |