This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.
The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.
Utbyte av näringsämnen, gaser och avfallsprodukter under eutherian dräktighet medieras av placenta. I de kvinnliga reproduktionsorganen, livmodern artärerna är de viktigaste ledningarna i blod till livmodern. Efter implantation, dessa filial till specialiserade fartyg kallas spiral artärer som spolen genom decidua basalis mot fetoplacental enheten. Diameter och elasticiteten hos dessa spiral artärer, som är omgivna av leukocyter, i synnerhet livmoder naturliga mördar (UNK) -celler, diktera volym och hastigheten hos blod som finns tillgänglig för placenta 1,2. Rätt hemodynamiska förändringar till följd av ombyggnad av spiral artärerna är avgörande för graviditet framgång.
Även om de bakomliggande mekanismerna skiljer sig i detalj mellan människa och mus graviditet, är det slutliga resultatet av ombyggnad processen i båda arterna dilaterad, hög ledningsförmåga kärl som förlorar sin släta muskelskiktet. Hos möss, UNK-cellerna interferon (IFN-) γ är nödvändig för att framkalla dessa förändringar på omkring mitten av dräktigheten 3-5. Möss som saknar antingen NK-celler eller komponenter i IFN-γ signalväg inte genomgå dessa förändringar och det är förenat med minskad fostertillväxt 6,7, betonar vikten av en tillräcklig blodtillförsel till fetoplacental enheten. Under tidig graviditet, den interstitial och endovaskulär invasion av extravillous trofoblast och deras samverkan med Unk celler är viktiga för att inducera kärlförändringar och främja fostertillväxt 8-10. UNK celler kan iscensätta humana trofoblast invasion genom kemokiner 11 och cytokiner såsom granulocyt makrofag – kolonistimulerande faktor (GM-CSF) 12. Grunt trofoblast invasion är förknippad med minskad arteriell remodeling och graviditetskomplikationer såsom havandeskapsförgiftning 9.
Detta protokoll är baserad på pionjärarbete av Anne Croy som beskrev den viktigaroll i immunsystemet och i synnerhet NK-härledd IFN-γ för framgångsrik kärlremodellering genom immunohistokemi och elegant överföringsexperiment 5,13. Här beskriver vi ett snabbt och ekonomiskt sätt för att bedöma ombyggnad status spiralartärer. Även om vårt labb bedömer rutinmässigt detta i mitten av dräktigheten (dräktighetsdagen (gd) 9,5) 14, tar remodelleringsprocessen mellan gd8.5 och 12,5 15. Tillkomsten av automatiserade glida skannrar har i hög grad underlättat bedömningen av fartyg och lumenområden från avsnitt och vi fann att det är en mer reproducerbar metod än att mäta kärldiameter. Tillsatsen av immunhistokemisk detektion av SMA möjliggör en enkel validering av de resultat som erhållits från stereologisk bedömning. Som med alla stereologisk teknik, är det rekommenderat att utföra bedömningen som förblindad experiment med minst två granskare. För detta ändamål kan ett slumpsteg införas när serie klippating proven så att utredarna bedömer bilderna inte vet varifrån experimentgruppen proverna kommer.
Det övergripande målet med detta protokoll är att tillhandahålla ett pålitligt verktyg för att noggrant bedöma ombyggnad av spiralartärer hos möss med definierade moderns och faderns genotyper, i samband med musmodeller för graviditetsrelaterade komplikationer. Resultaten understryker beroendet UNK celler av denna process, som är nödvändigt för normal fostertillväxt.
Protokollet som presenteras här är utformad för att åstadkomma en reproducerbar metod för att bedöma de vaskulära förändringar som är nödvändiga för en framgångsrik graviditet. Kritiskt för framgången av denna utvärdering är kvaliteten på vävnadssnitt. Både exakt bestämma graviditetslängd av implantationsställen liksom tillförlitligt ligering livmodern artärerna är avgörande steg. Förändringar i parametrar såsom tidpunkten för fixering, vävnadsbehandlingsprotokoll, etc, kan också påverka resultatet. För en opartisk stereologisk bedömning, är det viktigt att mäta samma antal fartyg i varje implanteringsstället. Det rekommenderas att mäta 5 fartyg per implanteringsstället och varje implanteringsstället i tre exemplar. Medelvärdet av dessa 15 mätningar representerar medelstorleken av de 5 största fartygen.
Med hänvisning till data från alymphoid Rag2 – / – IL2rg – / – möss som visas här, vi hittade denna protocol användbara för ett antal modeller av bristande moderns immunförsvar, inklusive en av hämmade NK-celler 14. Defekter i artär ombyggnad har också visats i modeller av nedsatt trofoblaster invasion 18 och de metoder som beskrivs här kan vara till hjälp för att bedöma kärl i dessa fall. Vi optimerade och validerat detta protokoll för utredning av decidual kärlremodellering i mitten av dräktigheten i mus, men det är också tänkbart att anpassa detta protokoll för att arbeta i andra modellsystem (t.ex. råttor) eller till och med i andra organ. Medan vi finner att NK-beroende ombyggnad kan kraftigt bedömas på gd9.5, kan det ändras till andra tidpunkter såsom gd12.5, när moderns kärl är helt ombyggd. Vid denna tidpunkt, är endovaskulär trofoblast invasion djupare 16 och denna tidpunkt kan vara mer lämpade för undersökningar av rollen som trofoblast för kärlförändringar. Om ytterligare kvantitativa avläsningar önskas,utredare kan också öka antalet sektioner färgade för SMA och bedöma andelen delvis ombyggda fartyg inom varje implanteringsstället.
En begränsning av detta protokoll är beskrivande karaktär histologiska undersökningar. Funktionella analyser, dock endast långsamt blir tillgängliga (t.ex. Doppler ultraljud 19). Dessa tekniker kräver teknisk expertis och mycket högre kostnader för att förvärva och underhåll av utrustning, men har fördelen att tillhandahålla en längsgående in vivo avläsning för effekten av de förändringar som kan observeras histologiskt. En möjlig nackdel med alla stereologisk undersökningar är subjektivitet utredarna. För detta ändamål kan med hjälp av två oberoende granskare som analyserar alla prover oberoende bidra till att undvika det här problemet. Medan det protokoll som beskrivs här ger insikt i hur mycket blod kan nå fetomaternal gränssnittet, kan det vara fördelaktigt att kombinera den med komplementary metod för att bedöma den totala mängden blod vid varje given tidpunkt i kärlsystemet genom plasten kastar 16.
Styrkan i detta protokoll är att den kombinerar två oberoende metoder. Kärl förändring först kvantitativt utvärderas av stereology och resultatet sedan valideras kvalitativt med hjälp av immunohistokemi. Tillförlitligheten av resultaten kan förstärkas ytterligare genom randomisering proven. Proven förberedda för detta protokoll kan enkelt användas för att även undersöka andra parametrar av graviditeten såsom decidualisation, utveckling av mesometrial lymfoid aggregat av graviditet (MLAp) eller immunodetektion av celler av intresse, att strikt utvärdera en graviditet fenotyp på midgestation.
Arteriell ombyggnad är ett kritiskt steg för okomplicerade graviditeter hos kvinnor och misslyckande av dessa förändringar ligger till grund för stora obstetrisk syndrom (GOS), nämligen havandeskapsförgiftning, fostertillväxt begränsning ochdödfödsel. Vi presenterar här tekniker för att noggrant bedöma en graviditet fenotyp i musmodeller som efterliknar vissa egenskaper hos patofysiologi GOS.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.
C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
Dental floss | |||
Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
25G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
Microtome | Leica | RM2245 | |
Slide rack | Sigma | Z710989 | |
Coplin jar | Sigma | S5891 | |
Purified water | |||
Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
Fume hood | |||
Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |