Method Article

의 Mechanosensation에 대한 행동 분석 클론의 MARCM은 기반 초파리

DOI:

10.3791/53537

⸱

December 30th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, College of the Holy Cross, 2School of Medicine, Georgetown University, 3Department of Biochemistry, Giesel School of Medicine, Dartmouth College, 4School of Medicine, Tufts University, 5Transgenomic Inc., 6Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMass Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기계감각에 영향을 미치는 새로운 돌연변이를 식별하기 위해 MARCM 방법에 의해 생성된 돌연변이 클론에서 파리 강모의 촉각 자극에 대한 행동 반응을 측정하는 분석을 설계했습니다. 이 기술의 결합을 통해 그렇지 않으면 치명적일 수 있는 기계민감성 돌연변이를 식별할 수 있습니다.

Abstract

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때문에 포유류 내이의 머리 셀 구조 및 기능의 상 동성, 초파리 외부 감각 기관을 뉴런에 분포 mechanosensation의 연구에 훌륭한 모델 시스템을 제공한다. 이 프로토콜은 mechanosensation 방해 변이를 식별하는데 사용될 수 초파리 간단한 터치 동작을 설명한다. 파리의 가슴이 중 첫 번째 또는 세 번째 다리에서 정리 반사를 이끌어에 macrochaete의 촉각 자극은 다름. mechanotransduction (예 : NOMPC 등)을 방해 돌연변이는, 또는 반사 아크의 다른 측면과 함께, 정리 반응을 억제 할 수 있습니다. 성인 행동의 전통적인 화면은 개발 과정에서 중요한 역할을 돌연변이를 놓친 것이다. 대신,이 프로토콜은 expr에 의해 생성 및 표시 할 동형 접합성 돌연변이 세포의 제한된 영역을 허용하도록 repressible 세포 마커 (MARCM) 모자이크 분석과 터치 스크린을 결합녹색 형광 단백질 (GFP)의 ession. 비정상적인 행동 반응을 위해 MARCM 클론을 시험함으로써,보다 전통적인 방법에 의해 누락되었을 mechanosensation 관련된 새로운 유전자를 검색 치명적인 P 요소 돌연변이 컬렉션 선별 할 수있다.

Introduction

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인간은 접촉, 압력, 진동 또는 음파와 같은 환경의 기계적 자극을 신경계에서 처리할 수 있는 감각 정보로 변환하는 능력에 의존합니다. 인간과 무척추동물 사이의 기계전달의 전반적인 기계론적 특징의 많은 부분이 동일하기 때문에1 초파리는 기계전달의 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용한 모델입니다. Drosophila melanogaster는 기계적 자극을 활동 전위로 변환할 수 있는 두 세트의 특수 감각 기관(유형 I 및 II)을 포함합니다. I형 기계수용체(mechanoreceptor)는 3개의 지지세포(support cell)로 둘러싸인 단일 수상돌기 또는 감각 돌기를 가진 뉴런을 가지고 있다2. I형 기계수용체(mechanoreceptor)는 강모 기계수용체(bristle mechanoreceptor), 민감한 청각 맥락막(chinstotonal organs, 존스턴 기관), 날개박동에 대한 정보를 전달하는 캄파니폼 센실라(campaniform sensilla)를 포함한다3. 파리의 등쪽을 덮고 있는 강모는 I형 기관 중 가장 풍부하고 쉽게 접근할 수 있습니다. 척추동물의 청력 및 균형과 관련된 유모 세포의 세포 외 환경과 유사하게, 파리 기계에 민감한 뉴런을 둘러싼 지지 세포는 칼륨1

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Protocol

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1. 십자가는 MARCM의 파리를 생성하려면

  1. 22도 섭씨 또는 표준 초파리 미디어 옥수수 가루 당밀 미디어 (0.13 % Tegosept, 23.5 G / L 효모, 60g / L의 옥수수 가루 60 ㎖ / L 당밀, 4 ㎖ / L 산 믹스 6.5 g /의 L 한천)에 파리를 유지 12 시간 빛 / 어둠주기.
    참고 : 표준 온도보다 낮은 건강 MARCM-주식을 유지하는 데 사용됩니다. 이 14 일에 계란과 성인 사이의 개발 시간을 연장한다.
  2. 상류 활성화 서열 (UAS-GFP) Gal80 리프레 서 단백질, GAL4 전사 인자의 제어하에 (GFP를 필요한 유전자 요소를 함유 MARCM 준비 스톡에서 - (8 일 오래 대략 1) 버진 암컷을 사용 열충격 종동 네이즈 및 FRT 재조합 부위).
    참고 : 우리의 MARCM 준비 주식은 다음과 같은 유전자형 포함 : elavGal4, UAS-CD8 - GFP, HS-flipase을; FRT40A, tubGal80 / CYO; tubGal4 / TM3Sb.
    주 : 특정 FRT 부위가 돌연변이의 위치에 의존 할 것이다게놈. 예를 들어, FRT40A는 NOMPC (MARCM 프로토콜에 대한 자세한 내용은 10 참조)와 같은 염색체 2의 왼쪽 팔에....

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Results

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이 프로토콜의 성공은 크게 쓸만한 파리의 전체 수율에 따라, 열 쇼크의 효과는 유사 분열 재조합하고, 2 분 간격으로 자극 파리에서 강력한 행동 반응을 얻을 수있는 능력을 유발한다. 배아의 약 12​​.5 %가 필요 MARCM 요소 및 GFP 발현의 가능성이 eclose 성인의 약 16.67 %를 포함하는 것을 감안할 때, 그것은 시간 제한이 낳는 동안 계란의 높은 번호를 확인하는 것이 중요합니다. 성공적인 타임 드의 예는도 1a에 도시 된 프로토콜의 나머지 부분에서 사용되는 4 시간 간격을 걸치.

열 쇼크가 85 행하는 경우 - 알을 ​​낳는 후 100 시간을, 외부 감각 기관의 GFP 표지 수율은 가장 파리 표지 macrochaetae 하나 갖는, 가장 높다. 관심이 많은 지역은 testabl의 기지에서 동형 접합 세포를 포함.......

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Discussion

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돌연변이의 컬렉션 성인 선별 곤란할 것 치명적인 P 요소 돌연변이가 포함되어 있기 때문에이 프로토콜은이 프로토콜은 먼저 리와 루오 설명 복잡한 유전 적 기술을 사용한다. 초파리 mechanosensation에 영향을 미치는 돌연변이 선별 성인 행동 분석을 활용 (1999) 성인 치사를 회피 우와 루오로 프로토콜, (2006) 등의 상세한. MARCM은 동형 접합 세포의 클론 영역을 생성하는 상동 염색체 사이의 유사 분열 재조합을 유도한다. 이 영역은 때문에 유사 분열 재조합 동안 발생 리프레 서 단백질, 욕조 - GAL80의 손실 GFP로 표시되어 있습니다. 특정 유전자 유전자좌에서 동형 접합체 세포를 생성하는 MARCM를 사용함으로써, 유전자 기능은이 문서에서 설명 된 행동 분석 등 다양한 방법을 사용하여 날아 성인에서 연구 될 수있다.

숫자와 B 수 특정 유전자를 모두 제한 요인테스트 E는 파리의 게놈 내의 FRT 부위의 존재이다. 플라이 주식은 관심의 돌.......

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Disclosures

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저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

Acknowledgements

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하고 싶은 저자는 블루밍턴 재고 센터, Liqun 루오, 찰스 Zuker, 그리고 릴리와 여운 Nung 월 플라이 주식의 관대 한 공유 및 자금 조달을 위해 다음과 감사 : 학사 포드 학부 여름 원정대 (JD 및 SW에) SOMAS-URM (SW에), 르네와 앤서니 M. 말론, MD (DL에) 63 여름 연구 활동 (CL과 DL에) BD 회사 여름 연구 활동 제임스 '75 제인 Colihan 여름 연구 활동 (TO)를 통해 동창 / 홀리 크로스 대학의 부모 여름 연구 기금 (IMF)과 Stransky 재단 여름 연구 활동 (TO)이다. 실험실에서 모든 작업의​​ 지원을위한 거룩한 십자가의 대학에서 생물학과 및 학장의 사무실에 특별 감사합니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
맥주 효모 (25 lb)MP Biomedicals ICN90331225 플라이 푸드
옥수수 (25 lb)MP Biomedicals ICN90141125 플라이 푸드
한천 (1 lb)MoorAgar Inc.41004플라이 푸드
Tegosept (5 kg)Genesee20-259플라이 푸드
당밀 (1 갤런)Sugarmill 브랜드 - Thomsen Food Service02625플라이 푸드
프로피온산FisherA258-500플라이 푸드
인산FisherA260-500플라이 푸드
초파리 바이알, 내로우 (PS)Genesee32-109비행 문화
6oz 정사각형 바닥 병(PP)Genesee32-130플라이 문화
슬러그 - 플라스틱 플라이 병Genesee49-100플라이 문화
레이온 볼, 대형Genesee51-100플라이 문화
드로소 필러, 좁은Genesee59-168플라이 식품 준비
드로소 필러, 병Genesee59-170플라이 푸드 준비
8A-C / 기어 구동 실험실 교반기 C-클램프 마운트  1/15 HP, 700 rpm 가변 속도, 115 V, 50/60 Hz클리블랜드 믹서8A-C플라이 푸드 준비
물 재킷 주전자플라이 푸드 준비
일주 성장 챔버Forma Scientific온도 및 빛/어두운 주기 제어
수조VWR열용 쇼크
마이크로 가위 고급 과학 도구  15000-08머리 제거용
형광 해부 현미경ZeissSteREO Discovery V8 GFP 큐브(KSC295-814D) 대역 통과 필터 포함
Fluroscence Light SourceZeissX-Cite 120광섬유 광 파이프는 이를 쉽게 구성할 수 있게 해줍니다 
스코프 ZeissAxioCam ICc1
이미지 수집 소프트웨어Zeiss
얼음 양동이차가운 앤테시아
수제 콜드 앤테시아 트레이
습한 환경에서 탈락한 파리를 복구하기 위한플라스틱 상자
용 카메라 용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Grünert, U., Gnatzy, W. K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors. J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).
  2. Kernan, M. J. Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila. Pflugers Arch. 454, 703-720 (20....

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MARCM ClonesMechanosensation AssayDrosophila MelanogasterGrooming ReflexMosaic AnalysisBristle StimulationGFP MarkingBehavioral ScreeningNOMpc MutationFRT Sites

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