ADN electroporación, aislamiento e Imagen de miofibras
Summary
This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Abstract
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
Introduction
Miofibras individuales son células sincitiales grandes, altamente organizados. Hay unos cuantos modelos de cultivo celular de los músculos; Sin embargo, estos modelos tienen como principal limitación que no diferencian plenamente en miofibras maduras. Por ejemplo, las líneas celulares C2C12 y L6 se derivan de ratones y ratas, respectivamente a 1-4. En condiciones de privación de suero, las células mononucleares "-mioblastos como" dejan la proliferación, se someten a la retirada del ciclo celular, y entran en el programa miogénica formando células multinucleadas con sarcómeros, conocidos como miotubos. Con las condiciones de cultivo prolongados, miotubos pueden exhibir propiedades contráctiles y "contracción" en la cultura. Líneas celulares humanas han también ahora han establecido 5. Además de estas líneas de células inmortalizadas, mioblastos mononucleares se pueden aislar a partir de músculo y en las condiciones similares de privación de suero formará miotubos. Estas líneas celulares y cultivos de mioblastos primarios son altamente utilizarful, ya que pueden ser transfectadas con plásmidos o transducidas con virus y se usaron para estudiar los procesos biológicos celulares básicas. Sin embargo, estas células, incluso cuando inducida para formar miotubos, carecen de muchas de las características sobresalientes de organización músculo maduro. Específicamente, miotubos son mucho menores que las miofibras maduras individuales y carecen de la forma normal de miofibras. Críticamente, miotubos carecen transversales (T-) túbulos, la red membranosa necesaria para una eficiente Ca 2 + en libertad en todo el sarcoplasma.
Un método alternativo para mioblastos primarios o líneas de células miogénicas implica el uso de miofibras maduras. La transgénesis se puede emplear para establecer la expresión de proteínas etiquetadas, pero este método es costoso y consume tiempo. In vivo electroporación de músculo de ratón se ha convertido en un método preferido por su velocidad y fiabilidad 6-10.
Los métodos para la electroporación in vivo y el aislamiento eficiente de miofibras hahe sido optimizado para el músculo flexor corto de los dedos 6 ratón (FDB). Los métodos se pueden completar fácilmente y son mínimamente invasivo para inducir la expresión in vivo a partir de plásmidos. Este enfoque está ahora combinada con métodos de imagen de alta resolución de imagen, incluyendo después de la interrupción del laser del 6,7 sarcolema. La combinación de colorantes y expresión de proteínas marcadas con fluorescencia fluorescentes puede ser usado para monitorear los procesos biológicos celulares en miofibras maduras.
Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de electroporación para estudiar las proteínas etiquetadas con fluorescencia in vivo es ideal para el estudio de los músculos debido a la ausencia de modelos de líneas celulares adecuadas que reproducen fielmente toda la estructura celular del músculo. Este protocolo describe la utilización de la electroporación y la microscopía confocal de alta resolución para proporcionar imágenes detalladas de la localización de proteínas y la translocación después de la herida láser. Este método puede…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta obra fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones NS047726, NS072027 y AR052646.
Materials
| DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
| Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
| 1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
References
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