DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징
Summary
This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Abstract
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
Introduction
각각의 근섬유가 큰, 매우 조직 세포 융합 세포이다. 근육에 대한 몇 가지 세포 배양 모델이 있습니다; 그러나,이 모델은 완전히 성숙한 근섬유로 분화하지 않는 전공 제한으로있다. 예를 들어, L6 및 C2C12 세포주는 마우스 및 래트 각각 1-4로부터 유도된다. 혈청 기아 조건 하에서, 단핵 "근육 모세포 같은"세포 증식을 중단 세포주기 회수를 받아야하고 sarcomeres과 다핵 세포를 형성하는 근육 조직 프로그램에 입력 myotubes라고 함. 장기간 배양 조건으로, myotubes는 수축 특성을 나타낼 수 있으며, 문화의 "트". 인간 세포주는 이제 5 확립되었다. 이들 불멸화 세포주 이외에, 단핵구는 근육 아세포로부터 myotubes을 형성 할 것이다 혈청 기아 유사한 조건 하에서 분리 될 수있다. 이들 세포주 및 일차 근원 세포 배양 물은 높은 사용 아르FUL들은 플라스미드로 형질 감염 또는 바이러스 형질 도입 및 염기성 세포 생물학적 과정을 연구하기 위해 이용 될 수 있기 때문이다. myotubes를 형성하도록 유도 된 경우에는, 이들 세포는 심지어, 성숙한 근육 조직의 많은 두드러진 특징이 부족하다. 구체적 myotubes 개별 성숙한 근섬유보다 훨씬 작고 근섬유의 정상적인 형상이 부족하다. 비판적으로, myotubes는 가로 (T-) 세관 부족, myoplasm에 걸쳐 효율적으로 칼슘 2 + 릴리스에 필요한 멤브레인 네트워크.
차 근원 세포 또는 근육 조직 세포 라인에 다른 방법은 성숙한 근섬유를 사용하여 수반한다. 형질 전환은 태그 된 단백질의 발현을 확립하기 위해 사용될 수 있지만,이 방법은 비용과 시간이 소요된다. 마우스 근육의 생체 전기는 속도 및 신뢰성 6-10위한 바람직한 방법으로서 떠오르고있다.
생체 전기와 근섬유 하를 효율적으로 분리하는 방법마우스 굴근 심지 브레비스 (FDB) 근육 (6)에 최적화되어했습니다. 방법은 쉽게 완료 플라스미드에서 생체 내 발현 유도하는 최소 침습 있습니다 할 수 있습니다. 이 방법은 현재의 sarcolemma -6,7- 레이저 파쇄 촬상 비롯한 고해상도 영상화 방법과 결합된다. 형광 염료 및 형광 표지 된 단백질의 발현이 결합 성숙한 근섬유 세포에서 생물학적 과정을 모니터링하는데 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 내 형광 태그로 단백질을 연구하는 전기의 사용은 이상적으로 충실히 근육 전체 셀 구조를 복제 적합한 세포주 모델의 부재 주어진 근육의 연구를 위해 적합하다. 이 프로토콜은 레이저 상처 후 단백질 지역화 및 전좌의 상세한 화상을 제공하는 일렉트로 고해상도 공 초점 현미경의 사용률을 설명한다. 이 방법은 세포 골격 재구성, 인신 매매 및 융합을 포함한 다른 세포 과정을 연구?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NS047726, NS072027 및 AR052646은 건강의 국립 연구소에 의해 부여 지원되었다.
Materials
| DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
| Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
| 1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
References
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).
