DNA Elektroporation, isolering och avbildning av Myofibers
Summary
This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Abstract
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
Introduction
Enskilda myofibers är stora, mycket organiserade syncytial celler. Det finns några cellkulturmodeller för muskel; men dessa modeller har som stor begränsning att de inte till fullo differentieras till mogna myofibers. Till exempel är de C2C12 och L6-cellinjer härledda från möss och råttor, respektive 1-4. Under förhållanden med serumsvält, de mononukleära "myoblast liknande" celler upphör proliferation, genomgår cellcykeltillbakadragande, och gå in i myogenic programmet bildar flerkärniga celler med sarkomerer, kallad myotuber. Med längre odlingsbetingelser kan myotuber uppvisar kontraktila egenskaper och "rycka" i kultur. Humana cellinjer har nu också inrättats 5. Förutom dessa immortaliserade cellinjer, kan mononukleära myoblaster isoleras från muskel och under liknande betingelser i serumsvält kommer att bilda myotuber. Dessa cellinjer och primära myoblast kulturer är mycket användaFul eftersom de kan transfekteras med plasmider eller transduceras med virus och användes för att studera grundläggande cellbiologiska processer. Dessa celler, även när förmås att bilda myotuber, saknar många av de framträdande dragen i mogen muskel organisation. Specifikt myotuber är mycket mindre än enskilda mogna myofibers och saknar den normala formen av myofibers. Kritiskt, myotuber saknar tvär (T-) tubuli, den membran nätverk som krävs för effektiv Ca2 + frisättning hela myoplasm.
En alternativ metod för att primär myoblast eller myogena cellinjer innebär användning av mogna myofibers. Transgenes kan användas för att fastställa expression av märkta proteiner, men denna metod är kostsam och tidskrävande. In vivo-elektroporation av mus muskel har framträtt som ett föredraget förfarande för dess hastighet och tillförlitlighet 6-10.
Metoder för in vivo elektroporering och effektiv isolering av myofibers have optimerats för musen flexor digitorum brevis (FDB) muskel 6. Metoderna kan fyllas lätt och är minimalt invasiva att inducera in vivo expression från plasmider. Detta tillvägagångssätt kombineras nu med hög upplösning avbildningsmetoder inklusive avbildning efter laser avbrott i sarcolemma 6,7. Kombinationen av fluorescerande färgämnen och expression av fluorescensmärkta proteiner kan användas för att övervaka cellbiologiska processer i mogna myofibers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av elektroporering för att studera fluorescerande märkta proteiner in vivo är idealiskt lämpad för att studera muskeln med tanke på frånvaron av lämplig cellinje modeller som troget replikerar hela cellstrukturen hos muskeln. Detta protokoll beskriver användningen av elektroporering och högupplösta konfokalmikroskopi att ge detaljerad avbildning av protein lokalisering och translokation efter laser sårskada. Denna metod kan anpassas för att studera andra cellulära processer, inklusiv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag NS047726, NS072027 och AR052646.
Materials
| DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
| Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
| 1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
References
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).
