腫瘍細胞移動の研究および抗浸潤性薬物の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫の器官型スライス培養モデル
Summary
神経膠芽腫（GBM）の現在のex vivoモデルは、ヒト腫瘍浸潤の生理学的に関連する研究のために最適化されていない。ここでは、我々は、新鮮なヒトGBM組織からの器官型スライス培養物の生成および維持のためのプロトコールを提示する。経時顕微鏡法および定量的細胞移動分析技術の説明が提供される。
Abstract
グリア芽細胞腫（GBM）は、外科手術、化学療法および放射線療法にもかかわらず、極めて不良な予後を続けている。周囲の脳実質への進行性の腫瘍浸潤は、永続的な治療上の課題である。 GBMのための抗遊走療法を開発するためには、制御された実験のために生理学的に関連する背景を提供するモデル系が不可欠である。ここでは、外科的切除の間に得られたヒトGBM組織から切片培養を生成するためのプロトコールを提示する。これらの培養物は、動物異種移植片または単一細胞培養物を通さずにエクスビボ実験を可能にする。さらに、我々は、腫瘍細胞の移動挙動および治療への関連する応答を定量的に研究するために、細胞追跡と併せて経時的レーザー走査共焦点顕微鏡法の使用を記載する。スライスは、手術組織の獲得の90分以内に再現可能に生成される。レトロウイルス媒介性の蛍光細胞1aベーリング、共焦点画像化、および腫瘍細胞移動分析は、培養の2週間以内にその後完了する。私たちは、これらのスライス培養をうまく使用して、ヒトGBMにおける増加した遊走行動に関連する遺伝的要因を明らかにした。さらに、本発明者らは、抗マイグレーション療法に応答して患者特異的変異を検出するモデルの能力を検証した。進行中、ヒトGBMスライス培養は、パーソナル化された神経腫瘍治療を進めるために、治療薬に対する腫瘍感受性の迅速なエクスビボ評価のための魅力的なプラットフォームである。
Introduction
グリア芽腫（GBM）の実験研究は、ヒト疾患の必要な病理学的特徴、すなわち腫瘍細胞の移動および浸潤を忠実に再現するモデルの欠如によって妨げられている。比較2Dおよび3D インビトロ浸潤アッセイの研究ならびに3Dげっ歯類スライス培養モデルは、潜在的にヒトの疾患1、2、3に2Dシステムからの所見の翻訳可能を制限する、これら二つのコンテキストに機構的に異なる細胞移動のプログラムを発見しました。本明細書に記載される器官型腫瘍スライス培養およびイメージングパラダイムは、外科的切除から得られたex vivoヒト腫瘍組織の切片内での腫瘍細胞遊走の研究を可能にする。したがって、経時的共焦点顕微鏡法と組み合わせて外科的に切除された腫瘍組織の切片培養は、ネイティブの腫瘍細胞移動を研究するためのプラットフォームを提供する組織溶解または培養継代がない微環境。
腫瘍浸潤1、2、3、4、5を研究するために、ヒト腫瘍異種移植片、レトロウイルス誘導性腫瘍、および細胞オーバーレイから生成されたGBMの齧歯類脳切片培養モデルを用い広範な文献があります。最近、いくつかのグループが直接ヒトGBM組織6、7、8、9、10から器官型スライス培養物の生成を記載しています。しかし、スライス技術および培養培地に関して公開されたプロトコールの間には著しい変化がある。さらに、器官型スライス培養の使用は、細胞シグナルの変化を含む静的実験的エンドポイントに焦点を当てている死、増殖、死亡の原因となる。本明細書に記載のプロトコルは、経時的レーザー走査共焦点顕微鏡法による動的腫瘍細胞挙動の時間分解観察を組み込むことによって、従来のスライス培養パラダイムを拡張する。間11および腫瘍内12の最近の発見は、人間のGBMで13遺伝的変異は、腫瘍細胞の挙動および治療に対する腫瘍の応答にその意味で、この異質性を結びつけることの重要性を強調しています。ここでは、ヒト癌組織由来の直接スライス培養物を使用して腫瘍細胞の移動をほぼリアルタイムで視覚化するための合理的で再現性のあるプロトコールを報告する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒト癌組織由来の器官型スライス培養は、前臨床翻訳実験のための魅力的で十分に活用されていないプラットフォームを提供する。天然の腫瘍微小環境における移動、増殖、および細胞死に関する腫瘍細胞の集団レベルの挙動の理解は欠けている。重要なことに、細胞挙動のレベルで動的で時間分解された様式で治療に対する腫瘍応答を研究することは、治療抵抗性の新規メカニズムに光を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、Lee Niswander博士とRada Massarwa博士に、ここで述べたスライスカルチャー共焦点イメージングプロトコルの技術的専門知識と貢献に感謝したいと思います。脳腫瘍組織のスライスおよび培養パラメータの最適化に関する専門知識を提供したDr. Kalen Dionneに感謝します。
Materials
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
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