Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli
Summary
Günümüzde glioblastoma (GBM) 'nin ex vivo modelleri, insan tümörü invazyonunun fizyolojik olarak ilgili çalışması için optimize edilmemiştir. Burada, taze insan GBM dokusundan alınan organotipik dilim kültürlerinin üretimi ve bakımı için bir protokol sunuyoruz. Zaman atlamalı mikroskopi ve kantitatif hücre göç analiz tekniklerinin bir açıklaması sağlanmıştır.
Abstract
Glioblastom (GBM), cerrahi, kemoterapötik ve radyasyon tedavisine rağmen son derece kötü klinik prognoz taşımaya devam etmektedir. Çevreleyen beyin parankim içine progresif tümör invazyonu, kalıcı bir terapötik zorluğu temsil eder. GBM için anti-migrasyon terapileri geliştirmek için, kontrollü deneyler için fizyolojik açıdan alakalı bir arka plan sağlayan model sistemleri esastır. Burada, cerrahi rezeksiyon sırasında elde edilen insan GBM dokusundan dilim kültürleri üretmek için bir protokol sunmaktayız. Bu kültürler, hayvan ksenograftları ya da tek hücreli kültürler aracılığıyla pasifleştirilmeden ex vivo denemeye izin verir. Ayrıca, tümör hücrelerinin migratör davranışını nicel olarak incelemek ve terapötiklerle ilişkili tepkiyi incelemek için hücre izlemeyle birlikte konvansiyonel mikroskopi taramalı zaman atlamalı lazer taramasını tarif ediyoruz. Dilimler, cerrahi doku ediniminden 90 dakika sonra tekrarlanabilir bir şekilde üretilir. Retroviral aracılı fluoresan hücre laBeling, konfokal görüntüleme ve tümör hücresi migrasyon analizleri daha sonra kültürden iki hafta içinde tamamlanır. İnsan GBM'sinde artan göç davranışıyla ilişkili genetik faktörleri ortaya çıkarmak için bu dilim kültürlerini başarıyla kullandık. Ayrıca, modelin göç karşıtı tedavilere yanıt olarak hastaya özgü varyasyonu saptama yeteneğini doğrulamış bulunuyoruz. İleriye doğru ilerleyerek, insan GBM dilim kültürleri kişiselleştirilmiş nöro-onkolojik terapiyi ilerletmek için terapötik ajanlara tümör hassasiyetinin hızlı ex vivo değerlendirmesi için çekici bir platformdur.
Introduction
Glioblastomun (GBM) laboratuvar çalışması, insan hastalığının gerekli patolojik özelliklerini, yani tümör hücresi migrasyonu ve istilasını sadakatle tekrarlayan model eksikliği nedeniyle engellenmektedir. 2D ve 3D in vitro invazyon testlerinin yanı sıra 3B kemirgen dilim kültür modelleri ile karşılaştırmalı çalışmalar, bu iki bağlamda mekanik olarak birbirinden farklı hücresel göç programlarını ortaya çıkarmıştır, bu bulgular 2D sistemlerinden insan hastalığına 1 , 2 , 3'e çevrilebilirliği potansiyel olarak sınırlayıcıdır. Burada tarif edilen organotipik tümör dilim kültürü ve görüntüleme paradigması, cerrahi rezeksiyonla elde edilen ex vivo insan tümör dokusu dilimleri içindeki tümör hücresi göçünün incelenmesine izin verir. Böylece, cerrahi olarak rezeke edilen tümör dokusunun dilim kültürleri, zaman atlamalı konfokal mikroskopi ile birleştiğinde yerli halktaki tümör hücresi göçünü incelemek için bir platform oluştururlarDoku eritme veya kültür pasajı olmaksızın mikro ortam.
İnsan tümörü ksenograftlarından, retroviral kaynaklı tümörlerden ve tümör invazyonu 1 , 2 , 3 , 4 , 5'i çalışmak için hücresel bindirmelerden üretilen GBM'nin kemirgen beyin dilim kültürü modellerini kullanan geniş literatür var. Yakın geçmişte, birkaç grup organotipik dilim kültürlerinin üretimini doğrudan insan GBM dokusundan 6 , 7 , 8 , 9 , 10'dan anlattı. Bununla birlikte, dilimleme tekniği ve kültür ortamı ile ilgili yayınlanmış protokoller arasında belirgin bir farklılık var. Ayrıca, organotipik dilim kültürlerinin kullanımı, hücre sinyalindeki değişiklikleri içeren statik deneysel son noktalara odaklanmıştırNg, çoğalma ve ölüm. Burada tarif edilen protokol, zamana bağlı lokal tarama konfokal mikroskobu ile dinamik tümör hücresi davranışlarının zaman çözümlemeli gözlemini dahil ederek önceki dilim kültürü paradigmalarını genişletir. Arası 11 ve tümör içi, 12 yeni keşfi, insan GBM'de 13 genetik çeşitlilik tümör hücre davranışları ve tedavi tümör yanıtı üzerindeki etkileri ile bu heterojenite bağlama öneminin altını çizmektedir. Burada, bir insan kanser dokusundan doğrudan dilim kültürlerinin kullanımı için, yakın zamanda gerçek zamanlı olarak tümör hücresi göçünü görselleştirmek için aerodinamik ve tekrarlanabilir bir protokol bildirdik.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan kanser dokusundan alınmış organotipik dilim kültürleri, klinik öncesi translasyonel deneyler için cazip ve az kullanılan bir platform sağlar. Tümör hücrelerinin doğal tümör mikro ortamındaki göç, çoğalma ve hücre ölümüne ilişkin nüfus düzeyindeki davranışlarının anlaşılması eksiktir. Kritik olarak, hücre davranışı seviyesinde dinamik, zamanla çözülmüş biçimde terapiye tümör tepkisinin incelenmesi, yeni tedavi direnci mekanizmalarına ışık tutabilir. İnsan tümör …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Burada açıklanan dil kültürü konfokal görüntüleme protokolüne teknik uzmanlıkları ve katkıları için Dr. Lee Niswander ve Dr. Rada Massarwa'ya teşekkür etmek istiyoruz. Dr. Kalen Dionne, beyin tümörü doku dilimleme ve kültür parametrelerinin optimize edilmesine ilişkin uzmanlık sağlayan ek teşekkürler sayesinde teşekkür ederiz.
Materials
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
References
- Beadle, C., et al. The role of myosin II in glioma invasion of the brain. Mol Biol Cell. 19, 3357-3368 (2008).
- Farin, A., et al. Transplanted glioma cells migrate and proliferate on host brain vasculature: a dynamic analysis. Glia. 53, 799-808 (2006).
- Panopoulos, A., Howell, M., Fotedar, R., Margolis, R. L. Glioblastoma motility occurs in the absence of actin polymer. Mol Biol Cell. 22, 2212-2220 (2011).
- Ivkovic, S., et al. Direct inhibition of myosin II effectively blocks glioma invasion in the presence of multiple motogens. Mol Biol Cell. 23, 533-542 (2012).
- Assanah, M., et al. Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet-derived growth factor-expressing retroviruses. J Neurosci. 26, 6781-6790 (2006).
- Chaichana, K. L., et al. Preservation of glial cytoarchitecture from ex vivo human tumor and non-tumor cerebral cortical explants: A human model to study neurological diseases. J Neurosci Methods. 164, 261-270 (2007).
- Grube, S., et al. Overexpression of fatty acid synthase in human gliomas correlates with the WHO tumor grade and inhibition with Orlistat reduces cell viability and triggers apoptosis. J Neurooncol. 118, 277-287 (2014).
- Hovinga, K. E., et al. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neurooncol. 15, 670-681 (2013).
- Xu, J., et al. Vorinostat modulates cell cycle regulatory proteins in glioma cells and human glioma slice cultures. J Neurooncol. 105, 241-251 (2011).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities. in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer cell. 17, 98-110 (2010).
- Gill, B. J., et al. MRI-localized biopsies reveal subtype-specific differences in molecular and cellular composition at the margins of glioblastoma. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 12550-12555 (2014).
- Snuderl, M., et al. Mosaic amplification of multiple receptor tyrosine kinase genes in glioblastoma. Cancer cell. 20, 810-817 (2011).
- Kakita, A., Goldman, J. E. Patterns and dynamics of SVZ cell migration in the postnatal forebrain: monitoring living progenitors in slice preparations. Neuron. 23, 461-472 (1999).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Sem Cell Dev Biol. 20, 894-902 (2009).
- Parker, J. J., et al. Gefitinib selectively inhibits tumor cell migration in EGFR-amplified human glioblastoma. Neurooncol. 15, 1048-1057 (2013).
- Brat, D. J., et al. Pseudopalisades in glioblastoma are hypoxic, express extracellular matrix proteases, and are formed by an actively migrating cell population. Cancer Res. 64, 920-927 (2004).
- Shweiki, D., Itin, A., Soffer, D., Keshet, E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature. 359, 843-845 (1992).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 647-664 (2014).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60, 502-514 (2012).
- Di Cristofori, A., et al. The vacuolar H+ ATPase is a novel therapeutic target for glioblastoma. Oncotarget. 6, 17514-17513 (2015).
- Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proc Natl Acad Sci USA. , 8352-8356 (2010).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. Br J Cancer. 110, 479-488 (2014).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. J Clin Pathol. 66, 253-255 (2013).
- Maund, S. L., Nolley, R., Peehl, D. M. Optimization and comprehensive characterization of a faithful tissue culture model of the benign and malignant human prostate. Lab Invest. 94, 208-221 (2014).
