Un modello di cultura organica fetta di Glioblastoma umano per lo studio della migrazione delle cellule tumorali e degli effetti specifici del paziente di farmaci antiinvasivi
Summary
I modelli attuali ex vivo di glioblastoma (GBM) non sono ottimizzati per studi fisiologicamente rilevanti di invasione tumorale umana. Qui presentiamo un protocollo per la generazione e la manutenzione di culture organiche di fetta da tessuti freschi umani GBM. Viene fornita una descrizione della microscopia a tempo trascorso e tecniche quantitative di analisi delle migrazioni di cellule.
Abstract
Glioblastoma (GBM) continua a portare una prognosi clinica estremamente scarsa, nonostante terapia chirurgica, chemioterapica e radioterapia. L'invasione tumorale progressiva nel parenchima del cervello circostante rappresenta una dura sfida terapeutica. Per sviluppare terapie anti-migrazione per GBM, sono essenziali sistemi di modello che forniscono un background fisiologicamente rilevante per la sperimentazione controllata. Qui presentiamo un protocollo per la generazione di culture di fetta da tessuto umano GBM ottenuto durante la resezione chirurgica. Queste colture permettono la sperimentazione ex vivo senza passaggio attraverso xenograft di animali o colture di cellule singole. Inoltre, descriviamo l'uso di microscopia confocale di scansione laser a tempo intervallato in combinazione con il monitoraggio delle cellule per studiare quantitativamente il comportamento migratorio delle cellule tumorali e la risposta associata alle terapie. Le fette sono generate in modo riproducibile entro 90 minuti dall'acquisizione di tessuti chirurgici. Cellula fluorescente mediata retroviralmente laIl rilievo, l'imaging confocale e le analisi delle migrazioni delle cellule tumorali vengono successivamente completate entro due settimane dalla cultura. Abbiamo utilizzato con successo queste culture di fetta per scoprire i fattori genetici associati ad un aumento del comportamento migratorio nel GBM umano. Inoltre, abbiamo convalidato la capacità del modello di individuare variazioni specifiche del paziente in risposta alle terapie anti-migrazione. Passando in avanti, le colture umane GBM fetta sono una piattaforma attraente per una rapida valutazione ex vivo della sensibilità tumorale agli agenti terapeutici, al fine di favorire la terapia neuro-oncologica personalizzata.
Introduction
Lo studio di laboratorio del glioblastoma (GBM) è ostacolato da una mancanza di modelli che ricapitolano fedelmente le caratteristiche patologiche necessarie della malattia umana, vale a dire la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Gli studi comparativi relativi ai test di invasione in vitro 2D e 3D, nonché i modelli di coltura a fetta di roditori 3D, hanno messo in evidenza programmi migratori cellulari disarmati meccanicamente in questi due contesti, potenzialmente limitando la traducibilità dei risultati dei sistemi 2D alla malattia umana 1 , 2 , 3 . Il paradigma della coltura del tumore dell'organotipo e del processo di imaging qui descritto consente lo studio della migrazione delle cellule tumorali all'interno di fette di tessuto tumorale umano ex vivo ottenuto da resezione chirurgica. Così, le colture di tessuti tumorali chirurgicamente resecati in combinazione con la microscopia confocale a tempo scadere forniscono una piattaforma per studiare la migrazione delle cellule tumorali nel nativoMicroambiente senza dissoluzione del tessuto o passaggio della cultura.
C'è una vasta letteratura che utilizza modelli di coltura di fegato di cervello di roditore di GBM generati da tumori umani xenografts, tumori indotti da retrovirus e sovrapposizioni cellulari per studiare l'invasione tumorale 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Recentemente, diversi gruppi hanno descritto la generazione di colture di fetta organotipiche direttamente dal tessuto GBM umano 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . Tuttavia, vi è una marcata differenza tra i protocolli pubblicati per quanto riguarda la tecnica di affettatura e il supporto della cultura. Inoltre, l'uso di culture di fetta organotipiche si è concentrato sugli endpoint sperimentali statici che hanno incluso i cambiamenti nei segnali cellulariNg, proliferazione e morte. Il protocollo qui descritto si espande sui precedenti paradigmi della coltura della fetta incorporando un'osservazione temporale del comportamento delle cellule tumorali dinamiche attraverso la microscopia confocale di scansione laser a tempo scadente. La scoperta recente della variazione genetica di inter 11 e intratumoral 12 , 13 nel GBM umano sottolinea l'importanza di collegare questa eterogeneità con i comportamenti delle cellule tumorali e le sue implicazioni sulla risposta tumorale alla terapia. Qui riportiamo un protocollo semplificato e riproducibile per l'utilizzo di culture di fetta diretta da un tessuto tumorale umano per visualizzare la migrazione delle cellule tumorali in quasi tempo reale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le colture organotipiche di fetta del tessuto tumorale umano forniscono una piattaforma attraente e inutilizzata per la sperimentazione preclinica di traslazione. La comprensione dei comportamenti a livello di popolazione delle cellule tumorali per quanto riguarda la migrazione, la proliferazione e la morte cellulare nel microambiente del tumore nativo manca. Critico, studiare la risposta tumorale alla terapia in modo dinamico e temporaneo a livello di comportamento delle cellule possono illuminare nuovi meccanismi di r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il dottor Lee Niswander e il dottor Rada Massarwa per la loro competenza tecnica e contributi al protocollo di imaging confocale della cultura di fetta qui descritto. Più ulteriormente grazie al dottor Kalen Dionne che ha fornito le competenze per quanto riguarda l'ottimizzazione dei parametri di affettatura e cultura del tessuto tumorale cerebrale.
Materials
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
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