Vi presenterer en metode for å isolere den voksne organ Corti som tre intakte cochlea svinger (apex, midtre og basen). Vi viser også en prosedyre for farging med fluorescently merkede antistoffer. Sammen disse teknikkene tillater studier av hårceller, støtte celler, og andre celletyper som finnes i sneglehuset.
The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.
Den spiralformede sneglehuset i det indre øret, som finnes i tinningbenet, huser organ Corti, det auditive sanse slutten organ hos pattedyr. Sneglehuset er tonotopically organisert og vanligvis delt inn i apikale, midtre og basal svinger tilsvarende forskjellige frekvens regioner med høyfrekvent lyd deteksjon i bunnen og lav frekvens deteksjon i apex en. Hårceller, de mechanosensory celler av organ Corti, kjører lengden av sneglehuset, som er ca 6 mm lang i mus 2,3. Disse cellene omdanne mekanisk energi av lydbølger som sendes gjennom væskefylte membran labyrint, inn nevrale signaler som behandles av sentrale hørsels strukturer. Teknikken er beskrevet her gir en metode for fremstilling av hele festene på den organ Corti etter forkalkning i sneglehuset er ferdig (for prøver fra én uke gamle til voksen). Vi presenterer også en fremgangsmåte for immunostaining hele montert cochlea vev. Cochlea hele monteringer er avgjørende for visualisering av alle hårceller og omkringliggende støtte celler i deres naturlige romlige arrangementer og muliggjøre analyse i tre dimensjoner ved bruk av konfokal mikroskopi.
Drs. Hans Engstrom og Harlow Ades opprinnelig beskrevet en hel montere cochlea disseksjon metode i 1966. De detalj en teknikk for å raskt fikse og dissekere forkalket cochleae nedsenket i væske fra en rekke pattedyr, bevare korte intakte segmenter av organ Corti for mikroskopisk analyse 4. Disseksjon av en unfixed, forkalket rotte cochlea har også blitt vist på en instruksjonsvideo 5. Drs. Barbara Bohne og Gary Harding ved Washington University gjort flere viktige endringer i denne metoden. I sin versjon av cochlea hele mount metode, tinningbenet var decalcified, forankret i plast, og fem halv svinger eller ti kvart svinger var dissected 6,7. Dr. Charles Liberman og kolleger ved Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye og Ear Infirmary, endret denne teknikken slik at plast embedding ikke var nødvendig 8. Ytterligere modifisering av teknikken skjedde i Dr. Jian Zuo laboratoriet ved St. Jude Children Research Hospital 9-12 som informerte disseksjon Metoden som presenteres her. Vi bruker en annen strategi for å få tilgang til organ Corti enn Bohne og Liberman, som tillater isolering av komplett apikal, midtre og basal svinger. Dermed dissekert vev er større og mindre sannsynlighet for å bli tapt eller skadet under disseksjon eller farging prosesser. I tillegg forenkler den nåværende fremgangsmåten måling av avstanden fra den apikale tupp eller basal krok for å identifisere en frekvens region.
Selv om mange laboratorier utføre farging av cochlea vev, er det uklart hvor denne metoden oppsto. Som et resultat er det ulike oppskrifter for å blokkere buffers og antistoff ruge buffere som kan påvirke ytelsen til enkelte primære antistoffer. Her presenterer vi en metode for farging med fluorescently merkede antistoffer som er aktuelt for de mest brukte antistoffer i hørselsfeltet.
Den komplekse form av sneglehuset, delikat strukturen i organ Corti, og benete encasement gir en utfordring for histologiske og biokjemiske analyser. En rekke forskjellige teknikker er for tiden brukes i høre feltet for å overvinne disse vanskelige funksjonene og visualisere cellene i organet Corti, hver teknikk med sine egne fordeler og ulemper. Protokollen som presenteres her muliggjør hel montering disseksjon av den voksne mus og cochlea, med små modifikasjoner, kan potensielt brukes til å undersøke de kritiske strukturer i cochleae fra en rekke andre modellorganismer som brukes i felten.
Det er flere viktige skritt for vellykket hele mount disseksjon og farging. Men før noen av disse metodene er utført, er riktig fiksering av cochlea vev nødvendig. Vi anbefaler å bruke metanol fri, ultra-rent, EM grade PFA. PFA laget av pulver kan ha spor av metanol og en ustabil pH som reduserer kvaliteten av immunfluorescens. Andre grupper har også vist at lignende disseksjoner er mulig ved hjelp av fiksativ som ikke inneholder formaldehyd 14-16. Lengden av fiksering er også viktig, og er spesif…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported in part by a grant from the Office of Naval Research (N000141310569). The Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility equipment was supported by the National Center for Research Resources-Health (S10RR027716).
Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | can be purchased from other vendors |
10.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | can be purchased from other vendors |
2 ml microcentrifuge tubes | MidSci | AVSS2000 | can be purchased from other vendors |
16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade | Polysciences | 18814 | TOXIC –wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors. |
PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | can be purchased from other vendors |
EDTA | Fisher | BP118-500 | can be purchased from other vendors |
end-over-end tube rotator | Fisher | 05-450-127 | can be purchased from other vendors |
60 mm petri dish | Fisher | 50-202-037 | can be purchased from other vendors |
Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
activated charcoal | Fisher | AC134372500 | can be purchased from other vendors |
stereo dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | can be purchased from other vendors |
Dumont #4 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
Dumont #5 jeweler's forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
2.5 mm Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | curved |
5 mm Vannas-Tubingen spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | straight |
48 well plates | Fisher | 08-772-52 | can be purchased from other vendors |
8 well chamber slides | Fisher | 1256518 | can be purchased from other vendors |
Triton X-100 | Sigma | X100-500 | can be purchased from other vendors |
BSA, fraction V | Fisher | BP1605 | can be purchased from other vendors |
NGS | Vector labs | S-1000 | can be purchased from other vendors |
NHS | Vector labs | S-2000 | can be purchased from other vendors |
3D rotator | Midsci | R3D-710 | can be purchased from other vendors |
Western blot incubation box XL | Licor | 929-97401 | |
Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | can be purchased from other vendors |
Prolong gold antifade mounting media | Life Technologies | P36930 | can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching |
Superfrost Plus Slides | Fisher | 12-550-15 | can be purchased from other vendors |
coverslips 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | can be purchased from other vendors |
clear nail polish | Local drug store | can be purchased from other vendors | |
cardboard slide folder | Fisher | 12-587-10 | can be purchased from other vendors |
plastic slide box | Fisher | 03-448-10 | can be purchased from other vendors |