Hele Mount Dissection og Immunfluorescens av Adult Mouse Cochlea

Summary

Vi presenterer en metode for å isolere den voksne organ Corti som tre intakte cochlea svinger (apex, midtre og basen). Vi viser også en prosedyre for farging med fluorescently merkede antistoffer. Sammen disse teknikkene tillater studier av hårceller, støtte celler, og andre celletyper som finnes i sneglehuset.

Abstract

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

Introduction

Den spiralformede sneglehuset i det indre øret, som finnes i tinningbenet, huser organ Corti, det auditive sanse slutten organ hos pattedyr. Sneglehuset er tonotopically organisert og vanligvis delt inn i apikale, midtre og basal svinger tilsvarende forskjellige frekvens regioner med høyfrekvent lyd deteksjon i bunnen og lav frekvens deteksjon i apex ^en. Hårceller, de mechanosensory celler av organ Corti, kjører lengden av sneglehuset, som er ca 6 mm lang i mus ^2,3. Disse cellene omdanne mekanisk energi av lydbølger som sendes gjennom væskefylte membran labyrint, inn nevrale signaler som behandles av sentrale hørsels strukturer. Teknikken er beskrevet her gir en metode for fremstilling av hele festene på den organ Corti etter forkalkning i sneglehuset er ferdig (for prøver fra én uke gamle til voksen). Vi presenterer også en fremgangsmåte for immunostaining hele montert cochlea vev. Cochlea hele monteringer er avgjørende for visualisering av alle hårceller og omkringliggende støtte celler i deres naturlige romlige arrangementer og muliggjøre analyse i tre dimensjoner ved bruk av konfokal mikroskopi.

Drs. Hans Engstrom og Harlow Ades opprinnelig beskrevet en hel montere cochlea disseksjon metode i 1966. De detalj en teknikk for å raskt fikse og dissekere forkalket cochleae nedsenket i væske fra en rekke pattedyr, bevare korte intakte segmenter av organ Corti for mikroskopisk analyse ^4. Disseksjon av en unfixed, forkalket rotte cochlea har også blitt vist på en instruksjonsvideo ^5. Drs. Barbara Bohne og Gary Harding ved Washington University gjort flere viktige endringer i denne metoden. I sin versjon av cochlea hele mount metode, tinningbenet var decalcified, forankret i plast, og fem halv svinger eller ti kvart svinger var dissected ^6,7. Dr. Charles Liberman og kolleger ved Eaton Peabody Laboratories, Massachusetts Eye og Ear Infirmary, endret denne teknikken slik at plast embedding ikke var nødvendig ^8. Ytterligere modifisering av teknikken skjedde i Dr. Jian Zuo laboratoriet ved St. Jude Children Research Hospital ^9-12 som informerte disseksjon Metoden som presenteres her. Vi bruker en annen strategi for å få tilgang til organ Corti enn Bohne og Liberman, som tillater isolering av komplett apikal, midtre og basal svinger. Dermed dissekert vev er større og mindre sannsynlighet for å bli tapt eller skadet under disseksjon eller farging prosesser. I tillegg forenkler den nåværende fremgangsmåten måling av avstanden fra den apikale tupp eller basal krok for å identifisere en frekvens region.

Selv om mange laboratorier utføre farging av cochlea vev, er det uklart hvor denne metoden oppsto. Som et resultat er det ulike oppskrifter for å blokkere buffers og antistoff ruge buffere som kan påvirke ytelsen til enkelte primære antistoffer. Her presenterer vi en metode for farging med fluorescently merkede antistoffer som er aktuelt for de mest brukte antistoffer i hørselsfeltet.

Den komplekse form av sneglehuset, delikat strukturen i organ Corti, og benete encasement gir en utfordring for histologiske og biokjemiske analyser. En rekke forskjellige teknikker er for tiden brukes i høre feltet for å overvinne disse vanskelige funksjonene og visualisere cellene i organet Corti, hver teknikk med sine egne fordeler og ulemper. Protokollen som presenteres her muliggjør hel montering disseksjon av den voksne mus og cochlea, med små modifikasjoner, kan potensielt brukes til å undersøke de kritiske strukturer i cochleae fra en rekke andre modellorganismer som brukes i felten.

Protocol

Etikk Uttalelse: Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Southern Illinois University School of Medicine. 1. Utvinning av Temporale Bones Identifisere timelige bein i bunnen av musen skallen 13 og skrape bort hjernenerver med standard mønster tang. Plasser standard mønster tang på spissen av otic kapsel og med tommelen på den andre hånden trykker ned på bakre halvsirkelformet kanalen for å l?…

Representative Results

Vi presenterer en metode for å isolere organ Corti som tre intakte cochlea svinger (apex, midtre og base) fra cochlea vev som er forkalket, med viktige disseksjon trinn presenteres i figur 1. Under den første postnatal uken i utvikling, forkalkning av mus sneglehuset er ufullstendig og en mer enkel disseksjon metoden kan brukes 13. Bruk av neonatal hele mount disseksjon metode med cochlea fra P7 og eldre mus resultater i tårer og makulering av orgelet i Cor…

Discussion

Det er flere viktige skritt for vellykket hele mount disseksjon og farging. Men før noen av disse metodene er utført, er riktig fiksering av cochlea vev nødvendig. Vi anbefaler å bruke metanol fri, ultra-rent, EM grade PFA. PFA laget av pulver kan ha spor av metanol og en ustabil pH som reduserer kvaliteten av immunfluorescens. Andre grupper har også vist at lignende disseksjoner er mulig ved hjelp av fiksativ som ikke inneholder formaldehyd ^14-16. Lengden av fiksering er også viktig, og er spesif…

Materials

Standard  pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	can be purchased from other vendors
10.5 cm fine scissors	Fine Science Tools	14060-11	can be purchased from other vendors
2 ml microcentrifuge tubes	MidSci	AVSS2000	can be purchased from other vendors
16% formaldehyde, methanol free, ultra pure, EM grade	Polysciences	18814	TOXIC –wear gloves and cannot be disposed of in the sink. Can be purchased from other vendors.
PBS pH 7.4	Sigma	P3813-10PAK	can be purchased from other vendors
EDTA	Fisher	BP118-500	can be purchased from other vendors
end-over-end tube rotator	Fisher	05-450-127	can be purchased from other vendors
60 mm petri dish	Fisher	50-202-037	can be purchased from other vendors
Dow Corning Sylgard 184 silicone encapsulant kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
activated charcoal	Fisher	AC134372500	can be purchased from other vendors
stereo dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000	can be purchased from other vendors
Dumont #4 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11241-30
Dumont #5 jeweler's forceps	Fine Science Tools	11251-20
2.5 mm Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15001-08	curved
5 mm Vannas-Tubingen spring scissors	Fine Science Tools	15003-08	straight
48 well plates	Fisher	08-772-52	can be purchased from other vendors
8 well chamber slides	Fisher	1256518	can be purchased from other vendors
Triton X-100	Sigma	X100-500	can be purchased from other vendors
BSA, fraction V	Fisher	BP1605	can be purchased from other vendors
NGS	Vector labs	S-1000	can be purchased from other vendors
NHS	Vector labs	S-2000	can be purchased from other vendors
3D rotator	Midsci	R3D-710	can be purchased from other vendors
Western blot incubation box XL	Licor	929-97401
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	can be purchased from other vendors
Prolong gold antifade mounting media	Life Technologies	P36930	can be purchased from other vendors,but mounting medias vary in their ability to protect against photobleaching
Superfrost Plus Slides	Fisher	12-550-15	can be purchased from other vendors
coverslips 22 x 22 x 1	Fisher	12-548-B	can be purchased from other vendors
clear nail polish	Local drug store		can be purchased from other vendors
cardboard slide folder	Fisher	12-587-10	can be purchased from other vendors
plastic slide box	Fisher	03-448-10	can be purchased from other vendors