एक प्रवाह के माध्यम से microreactor साथ एमएस का पता लगाने के लिए प्रोटीन की तेजी एंजाइमी प्रसंस्करण
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के विशाल बहुमत के आधार पर प्रोटीन विश्लेषण के तरीकों एक enzymatic पाचन कदम का पता लगाने के लिए पहले, आम तौर पर trypsin के साथ शामिल है। यह कदम मेगावाट <3,000-4,000 दा, कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री इंस्ट्रूमेंटेशन के प्रभावी सीमा स्कैन के भीतर गिर के साथ छोटे आणविक भार पेप्टाइड्स की पीढ़ी के लिए आवश्यक है, आम तौर पर। पारंपरिक प्रोटोकॉल 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन enzymatic पाचन शामिल है। हाल के अग्रिमों रणनीतियों की एक किस्म है, आम तौर पर स्थिर एंजाइमों के साथ या पूरक शारीरिक प्रक्रियाओं है कि समय प्रोटिओलिटिक पाचन के लिए आवश्यक कुछ ही मिनट के लिए कम (की एक श्रृंखला के जैसे, माइक्रोवेव या उच्च एक microreactor के प्रयोग को शामिल के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त किया है दबाव)। इस काम में, हम एक सरल और लागत प्रभावी दृष्टिकोण एक प्रोटीन की तेजी enzymatic पाचन प्राप्त करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है कि वर्णन है। प्रोटीन (या प्रोटीन मिश्रण) C18 बंधुआ उलट चरण उच्च perf पर adsorbed हैतरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) सिलिका के कण एक केशिका स्तंभ में पहले से लोड ormance, और जलीय बफर में trypsin समय की एक छोटी अवधि के लिए कणों पर संचार होता है। ऑन-लाइन एमएस का पता लगाने को सक्षम करने के tryptic पेप्टाइड्स एमएस आयन स्रोत में सीधे वृद्धि हुई कार्बनिक सामग्री के साथ एक विलायक प्रणाली के साथ eluted हैं। यह दृष्टिकोण उच्च कीमत स्थिर एंजाइम कणों के प्रयोग से बचा जाता है और इस प्रक्रिया को पूरा करने के लिए किसी भी सहायता की जरूरत नहीं है। प्रोटीन के पाचन और पूर्ण नमूना विश्लेषण और क्रमश: ~ कम से कम 3 मिनट में पूरा किया जा सकता ~ 30 मिनट।
Introduction
पहचान और शुद्ध प्रोटीन के लक्षण वर्णन अक्सर एमएस तकनीक का उपयोग करके हासिल की है। प्रोटीन एक एंजाइम से पच जाता है और उसके आगे पेप्टाइड्स एक सरल अर्क प्रयोगात्मक सेटअप का उपयोग करके एमएस द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं। प्रोटिओलिटिक पाचन छोटे पेप्टाइड टुकड़े कि ज्यादातर एमएस एनालाइजर की उपयोगी जन रेंज में गिरावट पैदा करने के लिए आवश्यक है, और है कि आसानी से अमीनो एसिड अनुक्रम जानकारी उत्पन्न करने के लिए कम ऊर्जा की टक्कर प्रेरित पृथक्करण के माध्यम से खंडित किया जा सकता है। पृथक प्रोटीन या सरल प्रोटीन मिश्रण के लिए, एमएस का पता लगाने के लिए पहले पेप्टाइड्स के chromatographic जुदाई के लिए आगे कोई जरूरत नहीं है। 25-50 पेप्टाइड्स का एक मिश्रण आसानी से एक सिरिंज एमएस आयन स्रोत में सीधे पंप के साथ नमूना infusing द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है।
मास स्पेक्ट्रोमीटर विश्लेषण करते हैं और एक कम समय-सीमा के भीतर एक प्रोटीन के अनुक्रम पुष्टि कर सकते हैं। आधुनिक डाटा अधिग्रहण तरीकों के साथ, इस प्रक्रिया को पूरा किया जा सकता wकुछ मिनट या यहां तक कि सेकंड Ithin। थोड़े समय के पैमाने पर पूरी प्रक्रिया को पूरा करने में सीमित कारक प्रोटिओलिटिक पाचन कदम है। सामान्यतया, यह (या हे / एन) में कुछ घंटे से अधिक किया जाता है, समाधान में 37 डिग्री सेल्सियस पर, सब्सट्रेट का उपयोग: (50-100) के एंजाइम अनुपातों: 1। मिनट या सेकंड, स्थिर एंजाइम microreactors को enzymatic पाचन समय, microfluidic रिएक्टरों या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कारतूस, वर्णित किया गया है के रूप में आम तौर पर कम करने के लिए। 1-6, एंजाइम सहसंयोजक, गैर सहसंयोजक / शारीरिक सोखना, जटिल से स्थिर है बड़े सतह करने वाली मात्रा और एंजाइम करने वाली सब्सट्रेट अनुपात के गठन या encapsulation, enzymatic प्रक्रिया के 3,6 बढ़ाया दक्षता से सक्षम किया जा रहा। स्थिर रिएक्टरों के अतिरिक्त लाभ एमएस विश्लेषण में एंजाइम से autolysis और हस्तक्षेप कम हो, एंजाइम स्थिरता और reusability में सुधार शामिल हैं। दृष्टिकोण, कांच का उपयोग कर या बहुलक microfabricated उपकरणों की एक किस्म का वर्णन किया गया है,एंटीबॉडी प्रतिजन बातचीत से चुंबकीय मोती पर स्थिर एंजाइमों का उपयोग कर, 7,8 वैकल्पिक रूप से सोने nanoparticle नेटवर्क में फँस, 9 टाइटेनिया एल्यूमिना प-जैल 10 और nanozeolites, 11 में समझाया या नी NTA या उनकी टैग जटिल गठन के माध्यम से कब्जा कर लिया। 6 , स्थिर एंजाइमों के साथ खुले ट्यूबलर केशिकाओं विकसित किया गया है, के रूप में अच्छी तरह से। 12 इसके अलावा, बढ़ाया प्रोटिओलिटिक दरार 30-120 की प्रतिक्रिया समय को कम करने के लिए नियंत्रित माइक्रोवेव विकिरण 13 या दबाव की मदद से या दबाव साइकिल चालन प्रौद्योगिकी (पीसीटी) का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है मि। 14
स्थिर एंजाइम रिएक्टरों के कई फायदे के बावजूद, वाणिज्यिक कारतूस की लागत अधिक है, नियमित प्रयोग के लिए microfluidic उपकरणों की उपलब्धता सीमित है, और अतिरिक्त उपकरण के लिए जरूरत होती माइक्रोवेव या पीसीटी प्रौद्योगिकियों के परिणाम का उपयोग करें। इस काम के लक्ष्य के लिए एक तरीका है कि circumve विकसित किया गया थाइन नुकसान एनटीएस, और है कि आसानी मिनट के भीतर एमएस विश्लेषण के लिए तैयार करने में प्रोटीन के enzymatic दरार प्रदर्शन के लिए एक सरल और प्रभावी दृष्टिकोण के साथ शोधकर्ताओं को सशक्त बनाने के लिए हर प्रयोगशाला में लागू किया जा सकता है। दृष्टिकोण हाइड्रोफोबिक, C18-कणों जो एक केशिका या microfluidic युक्ति में पहले से भरी हुई हैं के उपयोग पर निर्भर करता है, और अधिक से अधिक एंजाइम के अर्क के दौरान इन कणों enzymatic पाचन द्वारा पीछा किया पर ब्याज की प्रोटीन (एस) के सोखना खचाखच भरे बिस्तर और कब्जा कर लिया प्रोटीन (s)। इस दृष्टिकोण में, सब्सट्रेट गैर सहसंयोजक बातचीत के माध्यम से स्थिर है, और एंजाइम स्थिर प्रोटीन भर में संचार होता है। प्रोटिओलिटिक पाचन क्षमता, बड़े कण सतह क्षेत्रों है कि एंजाइमी प्रसंस्करण, कम दूरी और करने के लिए और कणों की सतह से प्रसार समय के लिए प्रोटीन का पर्दाफाश की वृद्धि हुई है बड़े पैमाने पर स्थानांतरण, कोई सहसंयोजक लगाव है कि एंजाइम की गतिविधि को प्रभावित कर सकता है, की क्षमता में सुधार करने के लिए जल्दी evaluatविभिन्न एंजाइमों, disposability, और बहुसंकेतन के ई संयोजन प्रक्रिया एक microfluidic प्रारूप में मार डाला जाता है। यह दृष्टिकोण मानक प्रोटीन और trypsin-प्रोटिओलिटिक पाचन ईएसआई-एमएस का पता लगाने के लिए पूर्व के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया एंजाइम का एक मिश्रण के उपयोग के साथ प्रदर्शन किया है। बड़े पैमाने पर इस अध्ययन में पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया स्पेक्ट्रोमीटर एक रेखीय जाल quadrupole (LTQ) साधन था।
Protocol
Representative Results
Discussion
microreactor इस काम में वर्णित प्रदान करता है एक आसान करने के लिए लागू कम से कम 30 मिनट में एमएस विश्लेषण और पहचान सक्षम करने के लिए प्रोटीन के enzymatic पाचन के प्रदर्शन के लिए प्रयोगात्मक स्थापना। इस प्रणाली, पारंपर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
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