Fast Enzymatisk Behandling av proteiner for MS Detection med en Gjennomstrømning mikroreaktor
Summary
A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.
Abstract
De aller fleste av massespektrometri (MS) -baserte protein analysemetoder involvere en enzymatisk fordøyelse skritt før deteksjon, typisk med trypsin. Dette trinnet er nødvendig for generering av små peptider molekylvekt, vanligvis med molekylvekt <3,000-4,000 Da, som faller innenfor det effektive skanne utvalget av massespektrometri instrumentering. Konvensjonelle protokollene omfatter O / N enzymatisk fordøyelse ved 37 ºC. Nylige fremskritt har ført til utviklingen av en rekke strategier, typisk involverer bruk av en mikroreaktor med immobiliserte enzymer eller av en rekke komplementære fysiske prosesser som reduserer den tiden som er nødvendig for proteolytisk spaltning til noen få minutter (f.eks mikrobølgeovn eller høy- trykk). I dette arbeidet, beskriver vi en enkel og kostnadseffektiv tilnærming som kan implementeres i en hvilken som helst laboratorium for å oppnå rask enzymatisk nedbrytning av et protein. Proteinet (eller proteinblanding) blir adsorbert på C18-bundet revers-fase høy performance flytende kromatografi (HPLC) silikapartikler forhåndslagret i en kapillær kolonne, og trypsin i vandig buffer blir infusert i løpet av de partikler for en kort periode. For å muliggjøre on-line MS deteksjon, blir de tryptiske peptidene ble eluert med et oppløsningsmiddelsystem med øket organisk innhold direkte i MS ionekilden. Denne tilnærmingen unngår bruk av dyre immobiliserte enzym partikler og ikke nødvendiggjøre noen hjelpemiddel for å fullføre prosessen. Proteinfordøyelsen og fullstendig analyse av prøver kan utføres på mindre enn ~ 3 min og ~ 30 min, respektivt.
Introduction
Identifiseringen og karakteriseringen av rensede proteiner blir ofte oppnådd ved hjelp av MS-teknikker. Proteinet blir spaltet med et enzym og dets peptider blir ytterligere analysert ved MS ved hjelp av en enkel tilførsel eksperimentelt oppsett. Proteolytisk fordøyelse er nødvendig for generering av små peptidfragmenter som faller i det nyttige massen utvalget av de fleste MS analysatorer, og som lett kan fragmenteres ved lav energi kollisjon indusert dissosiasjon for å generere aminosyresekvens informasjon. For isolerte proteiner eller enkle proteinblandinger, er det ikke lenger behov for kromatografisk separasjon av peptider før MS deteksjon. En blanding av 25-50 peptider kan lett analyseres ved infusjonen av prøven med en sprøytepumpe direkte i MS ionekilden.
Massespektrometer kan utføre analyse og bekreftet sekvensen til et protein innenfor en kort tidsramme. Med moderne datainnhentingsmetoder, kan denne prosessen gjøres wTVen på noen minutter eller sekunder. Den begrensende faktor i å fullføre hele prosessen på en kort tidsskala er den proteolytiske spaltning trinnet. Vanligvis er dette utføres i løpet av noen få timer (eller O / N), i oppløsning, ved 37 ° C, ved hjelp av substrat: enzymforhold på (50-100): 1. For å redusere den enzymatiske fordøyelse tid til å minutter eller sekunder, immobiliserte enzymmikroreaktorer, i form av microfluidic reaktorer eller kommersielt tilgjengelige patroner, har blitt beskrevet. 1-6 er typisk enzymet immobilisert ved kovalent, ikke-kovalent / fysisk adsorpsjon, kompleks dannelse eller innkapsling, 3,6 den forbedrede effektivitet av den enzymatiske prosess som blir aktivert av den store overflate-til-volum og enzym-til-substrat-forhold. Ytterligere fordeler av immobiliserte reaktorer inkluderer redusert autolyse og interferens fra enzymet i MS-analysen, forbedret enzymstabilitet og gjenbruk. En rekke tilnærminger, bruk av glass eller polymere microfabricated enheter har blitt beskrevet,ved hjelp av enzymer immobilisert på magnetiske kuler med antistoff-antigen interaksjoner, 7,8 fanget i gullnanopartikkel-nettverk, 9 innkapslet i Titania-alumina sol-gels 10 og nanozeolites, 11 eller fanget gjennom Ni-NTA eller His-tag kompleks formasjon. 6 Eventuelt åpen rørformede kapillærer med immobiliserte enzymer har blitt utviklet, så vel. 12 Videre har forbedret proteolytisk spaltning har blitt demonstrert ved hjelp av kontrollert mikrobølgestråling 13 eller trykkassistert eller trykk sykling teknologi (PCT) for å redusere reaksjonstiden til 30-120 min. 14
Til tross for de mange fordelene med immobilisert enzymreaktorer, vil kostnadene ved kommersielle patroner er høy, er tilgjengeligheten av microfluidic enheter for rutinemessig bruk begrenset, og bruk av mikrobølgeovn eller PCT teknologier medfører behov for ekstra instrumentering. Målet med dette arbeidet var å utvikle en metode som circumvents disse ulemper, og som enkelt kan implementeres i alle laboratorier for å styrke forskere med en enkel og effektiv metode for å utføre enzymatisk spaltning av proteiner i forberedelse for MS-analyse i løpet av minutter. Tilnærmingen er avhengig av bruk av hydrofobe, C18-partikler som er forhåndsinstallert i en kapillær eller mikrofluid enhet, og adsorpsjonen av protein (er) av interesse på disse partiklene, fulgt av enzymatisk nedbrytning under infusjonen av enzymet over hele pakket seng og fanges protein (er). I denne fremgangsmåten blir substratet immobilisert gjennom ikke-kovalente interaksjoner, og enzymet blir tilført over immobilisert protein. Den proteolytiske spaltning effektivitet blir øket ved de store partikkeloverflatearealer som eksponerer protein for enzymatisk behandling, redusert avstander og diffusjon ganger til og fra overflaten av partiklene, forbedret masseoverføring, ikke kovalent binding som kan påvirke aktiviteten av enzymet, evne til raskt evaluate kombinasjoner av forskjellige enzymer, disposability og multipleksing hvis prosessen utføres i et mikrofluid format. Denne tilnærmingen er demonstrert ved bruk av en blanding av standard proteiner og trypsin-de mest brukte enzym for proteolytisk fordøyelse før ESI-MS deteksjon. Massespektrometer som brukes for deteksjon i denne studien var en lineær felle kvadrupol (LTQ) instrument.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mikroreaktor som er beskrevet i dette arbeidet gir en lett-å-implementere eksperimentelle oppsett for å utføre enzymatisk fordøyelse av proteiner for å aktivere MS analyse og identifikasjon i mindre enn 30 min. De klare fordelene med dette system, i forhold til konvensjonelle tilnærminger inkluderer enkelhet, hastighet, lav reagens forbruk og lave kostnader. I særdeleshet er det ikke behov for kostbare immobilisert trypsin, perler og patroner. Utarbeidelsen av kapillær mikroreaktor er grei (figur 1A)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.
Materials
| Ion trap ESI-MS | Thermo Electron | LTQ | The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data |
| XYZ stage | Newport | Multiple parts | The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems |
| Stereo microscope | Edmund optics | G81-278 | The microscope is used to observe the microreactor packing process |
| Analytical balance/Metler | VWR | 46600-204 | The balance is used to weigh the protein samples |
| Ultrasonic bath/Branson | VWR | 33995-540 | The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry |
| Syringe pump 22 | Harvard Apparatus | 552222 | The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor |
| Milli-Q ultrapure water system | EMD Millipore | ZD5311595 | The MilliQ water system is used to prepare purified DI water |
| Pipettor/Eppendorf (1000 µL) | VWR | 53513-410 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (100 µL) | VWR | 53513-406 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipettor/Eppendorf (10 µL) | VWR | 53513-402 | The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions |
| Fused silica capillary (100 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP100375 | This capillary is used for the fabrication of the microreactor |
| Fused silica capillary (20 µm ID x 100 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP020090 | This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter |
| Fused silica capillary (50 µm ID x 360 µm OD) | Polymicro Technologies | TSP050375 | This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor |
| Glass capillary cleaver | Supelco | 23740-U | This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length |
| Glue | Eclectic Products | E6000 Craft | This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip |
| Epoxy glue | Epo-Tek | 353NDT | This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded |
| Reversed phase C18 particles (5 µm) | Agilent Technologies | Zorbax 300SB-C18 | These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4 mm x 20 cm C18 LC column from Agilent |
| Syringe/glass (250 µL) | Hamilton | 81130-1725RN | The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor |
| Internal reducing PEEK Union (1/16” to 1/32”) | Valco | ZRU1.5FPK | This union is used to connect the 250 µL syringe to the microreactor for loading the 5 µm particle slurry |
| Stainless steel union (1/16”) | Valco | ZU1XC | The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary |
| Microvolume PEEK Tee connector (1/32”) | Valco | MT.5XCPK | The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire |
| Tee connector (light weight) | Valco | C-NTXFPK | This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line |
| Pt wire (0.404 mm) | VWR | 66260-126 | The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply |
| PTFE tubing (1/16” OD) | Valco | TTF115-10FT | The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union |
| PEEK tubing (0.015“ ID x 1/16” OD) | Upchurch Scientific | 1565 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50 µm ID transfer capillary |
| PEEK tubing (0.015” ID x 1/32” OD) | Valco | TPK.515-25 | The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee |
| Clean-cut polymer tubing cutter | Valco | JR-797 | This cutter is used to pre-cut the 1/16” and 1/32’ Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length |
| Amber vial (2 mL) | Agilent | HP-5183-2069 | The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry |
| Amber vial (4 mL) | VWR | 66011-948 | The vials are used to prepare sample solutions |
| Polypropylene tube (15 mL) | Fisher | 12-565-286D | The vials are used to prepare buffer solutions |
| Cylinder (100 mL) | VWR | 24710-463 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Cylinder (10 mL) | VWR | 24710-441 | The cylinder is used to measure volumes of solvent |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-386 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (100 µL) | VWR | 53503-781 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Pipette tips (10 µL) | VWR | 53511-681 | The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions |
| Glass substrates | Nanofilm | B270 white crown, 3” x 3” | These are glass substrates for microchip fabrication |
| Male nut fitting (1/16”) | Upchurch | P203X | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Nanoport assembly | Upchurch | N-122H | This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip |
| Reagents | |||
| Protein standards | Sigma | Multiple # | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher | A955 | |
| Methanol, HPLC grade | Fisher | A452 | |
| Isopropanol, HPLC grade | Sigma | 650447 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma | 302031 | |
| Ammonium bicarbonate | Aldrich | A6141 | |
| Trypsin, sequencing grade | Promega | V5111 |
References
- Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics. , (2014).
- Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors. J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).
- Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. Microfluidic enzymatic reactors for proteome research. Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).
- Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance. LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).
- Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping. LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).
- Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. Enzyme-immobilized microfluidic process reactors. Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).
- Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. , 1071-1074 (2009).
- Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads. Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).
- Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).
- Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance. J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).
- Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors. Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).
- Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in "sub-chip" dimensions for sensitive protein mass spectrometry. Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).
- Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes. Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).
- Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis. Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).
- Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).
- Lazar, I. M., Kabulski, J. L. Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection. Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).
- Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip. Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).
- Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices. Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).
- Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells. J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).
- Doucette, A., Craft, D., Li, L. Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).
- Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening. Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).
- Lazar, I. M., Karger, B. L. Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,". Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).
- Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis. Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).
