Die Quantifizierung der zerebrale vaskuläre Architektur unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie in einem Mausmodell der HIV-induzierten Neuroinflammation
Summary
This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.
Abstract
Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.
Introduction
Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) dringt in das Gehirn während der akuten Phase der Virus-Infektion, und produktiv infiziert sowohl Mikroglia und Gehirn Makrophagen, was zu deren Aktivierung – und die Freisetzung von beiden Host-abgeleitete Entzündungsmediatoren und lösliche HIV-1 virotoxins wie Tat und gp120 (in 1,2 überprüft). Als Folge davon wird ein chronischer Zustand neuroinflammatorischen im ZNS, die vermutlich auf die Pathogenese der HIV-1-assoziierte neurokognitive Störungen (HAND) 3-5 beitragen etabliert.
Chronische Überexpression von HIV-1 Tat oder Interleukin (IL) -17A im ZNS von Mäusen wurde gezeigt, dass in der mikrovaskulären rarefaction 6,7 führen. Dies eröffnet die Möglichkeit, dass eine chronische Neuroentzündung kann zur Pathogenese von Hand durch Wirkung auf die zerebrale Gefäßsystem beizutragen. Um diese Frage weiter zu prüfen, haben wir Methoden, um zerebrale vaskuläre struc Quantifizierung entwickeltturen.
Dieser Beitrag beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung der Anzahl der Kapillar-Knoten, Kapillar Segmente bedeuten Segmentlänge, Gesamtsegmentlänge, bedeuten Kapillardurchmesser und Gesamt Kapillarvolumen mit In-vivo-Bildgebung von Kapillarnetzwerke durch eine dünne Schädel kortikalen Fenster (von zuvor beschriebenen modifizierten Protokolle) 8,9 sowie ex vivo-Abbildung von Gehirnschnitten unter Verwendung von Zwei-Photonen-Mikroskopie. Dieser kombinierte Ansatz sieht eine ganzheitliche Quantifizierung des zerebralen Gefäßparameter, da die in vivo-Dünn Schädel Kortikalisfenster ermöglicht die Erhaltung des zerebralen Umgebung während ex vivo-Abbildung von Kapillarnetzwerken in Hirnschnitten erlaubt die Rekonstruktion der vollständigen, dreidimensionalen Kapillarnetzwerke – die dann unter Verwendung im Handel erhältlicher Software quantifiziert werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Verfahren kann angewendet werden, um Gehirn mikrovaskulären Strukturen in einer breiten Palette von experimentellen Modellen / Einstellungen zu analysieren. Für den Erfolg dieser Methode müssen drei wichtige Schritte gemeistert werden. Erstens muss die dünne Schädelfenster den Schädel oder die zugrunde liegenden Hirn nicht beschädigen. Es ist leicht, den Schädel während der Ausdünnung zu durchstechen oder zu einem Hitze induzierte Gefäßdurchlässigkeit. Dies kann mit einer Abbildungs ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan, and Dr. Linda Callahan at the University of Rochester Multiphoton Core for technical advice throughout the completion of this protocol. We also thank Dr. Changyong Feng for expert statistical advice, and Dr. Maiken Nedergaard at the University of Rochester Medical Center for the headplate design used in this paper. This work was supported in part by grants T32GM007356 and R01DA026325 from the National Institutes of Health (NIH); and by the University of Rochester Center for AIDS Research grant P30AI078498 (NIH).
Materials
| Leica Microscope | Leica Inc. | MZ8 | |
| High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner | 180 | |
| Heating Pad | Stryker | TP3E | |
| T/PUMP | Gaymar Industries, Inc. | TP-500 | |
| TEC-4 Isoflurane Vaporizer | Datex Ohmeda | 447 | |
| Artificial Tear Gel | Butler AHS | 7312 | |
| Povidone-Iodine solution | Aplicare | 52380-1855-9 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Dumot #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Ferric Chloride Solution | Ricca Chemical Company | 3120-16 | |
| Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel | Henkel | 45404 | |
| Dental Cement | Stoelting | 51459 | |
| Microtoruqe II Handpiece Kit | Pearson Dental | R14-0002 | |
| 005 Burr for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Norland Blade (Dental Microblade) | Salvin Dental | 6900 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Group 2B Carcinogen |
| Braided Suture | Ethicon | 735G | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Arterial Catheter | SAI Infusion Technologies | MAC-01 | The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. |
| Blood Pressure Moniter | World Precision Intruments | SYS-BP1 | |
| Blood Pressure Transducer and Cable | World Precision Intruments | BLPR2 | |
| RAPIDLab Blood Gas Analyzer | Siemens | 248 | |
| 40 μl Capillary Tube | VWR | 15401-413 | |
| Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) | Invitrogen | D-1830 | |
| Adult Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope | Olypmus | FV-1000 MPE | |
| MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Spectra-Physics | ||
| ImageJ Software | National Institutes of Health (NIH) | Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
| Amira Software | Visage Imaging |
References
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