This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.
Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.
ह्यूमन इम्यूनो वायरस 1 (एचआईवी -1) वायरस के संक्रमण की तीव्र चरण के दौरान मस्तिष्क पर हमला है, और उत्पादकता अपने सक्रियण के लिए अग्रणी, microglia और मस्तिष्क निवासी मैक्रोफेज दोनों को संक्रमित करता है – और दोनों मेजबान व्युत्पन्न भड़काऊ मध्यस्थों और घुलनशील एचआईवी -1 की रिहाई ऐसे गूंथना और (1,2 में समीक्षा) gp120 के रूप में virotoxins। एक परिणाम के रूप में, एक पुरानी neuroinflammatory राज्य एचआईवी -1 एसोसिएटेड Neurocognitive विकार (हाथ) 3-5 के रोगजनन में योगदान करने के लिए सोचा है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में स्थापित हो जाता है।
एचआईवी -1 गूंथना या चूहों के सीएनएस के भीतर इंटरल्यूकिन (IL) में -17A की जीर्ण overexpression microvascular विरलीकरण 6.7 में परिणाम के लिए दिखाया गया है। यह पुरानी neuroinflammation प्रमस्तिष्क वाहिका पर प्रभाव के माध्यम से हाथ के रोगजनन में योगदान कर सकते हैं कि संभावना उठाती है। आगे इस सवाल की जांच करने के लिए, हम मस्तिष्क संवहनी struc यों करने के तरीकों को विकसित किया हैTures।
इस पत्र, खंड लंबाई, कुल खंड लंबाई मतलब केशिका व्यास, और एक पतली खोपड़ी cortical खिड़की के माध्यम से केशिका नेटवर्क के vivo इमेजिंग में उपयोग करते हुए कुल केशिका मात्रा मतलब है, केशिका नोड्स, केशिका खंडों की संख्या बढ़ाता के लिए एक विधि का वर्णन (पहले वर्णित से संशोधित प्रोटोकॉल) 8,9, साथ ही दो photon माइक्रोस्कोपी का उपयोग मस्तिष्क वर्गों के पूर्व vivo इमेजिंग,। इन विवो पतली खोपड़ी cortical खिड़की मस्तिष्क पर्यावरण के संरक्षण के लिए अनुमति देता है के बाद से मस्तिष्क के स्लाइस में केशिका नेटवर्क के पूर्व vivo इमेजिंग के पुनर्निर्माण के लिए सक्षम बनाता है, जबकि इस संयुक्त दृष्टिकोण, मस्तिष्क संवहनी मापदंडों के लिए एक समग्र quantitation के लिए प्रदान करता है तीन आयामी, पूरा केशिका नेटवर्क – तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।
यहाँ वर्णित विधि प्रयोगात्मक मॉडल / सेटिंग्स की एक विस्तृत श्रृंखला में मस्तिष्क microvascular संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए लागू किया जा सकता है। इस विधि की सफलता के लिए, तीन महत्वपूर्ण कदम में महारत हासिल…
The authors have nothing to disclose.
We thank Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan, and Dr. Linda Callahan at the University of Rochester Multiphoton Core for technical advice throughout the completion of this protocol. We also thank Dr. Changyong Feng for expert statistical advice, and Dr. Maiken Nedergaard at the University of Rochester Medical Center for the headplate design used in this paper. This work was supported in part by grants T32GM007356 and R01DA026325 from the National Institutes of Health (NIH); and by the University of Rochester Center for AIDS Research grant P30AI078498 (NIH).
Leica Microscope | Leica Inc. | MZ8 | |
High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner | 180 | |
Heating Pad | Stryker | TP3E | |
T/PUMP | Gaymar Industries, Inc. | TP-500 | |
TEC-4 Isoflurane Vaporizer | Datex Ohmeda | 447 | |
Artificial Tear Gel | Butler AHS | 7312 | |
Povidone-Iodine solution | Aplicare | 52380-1855-9 | |
Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Dumot #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Ferric Chloride Solution | Ricca Chemical Company | 3120-16 | |
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel | Henkel | 45404 | |
Dental Cement | Stoelting | 51459 | |
Microtoruqe II Handpiece Kit | Pearson Dental | R14-0002 | |
005 Burr for Micro Drill | Fine Science Tools | 19007-05 | |
Norland Blade (Dental Microblade) | Salvin Dental | 6900 | |
Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Group 2B Carcinogen |
Braided Suture | Ethicon | 735G | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Arterial Catheter | SAI Infusion Technologies | MAC-01 | The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. |
Blood Pressure Moniter | World Precision Intruments | SYS-BP1 | |
Blood Pressure Transducer and Cable | World Precision Intruments | BLPR2 | |
RAPIDLab Blood Gas Analyzer | Siemens | 248 | |
40 μl Capillary Tube | VWR | 15401-413 | |
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) | Invitrogen | D-1830 | |
Adult Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope | Olypmus | FV-1000 MPE | |
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser | Spectra-Physics | ||
ImageJ Software | National Institutes of Health (NIH) | Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | |
Amira Software | Visage Imaging |